通过式固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定牛乳和乳粉中4 种类固醇激素

刘 东，李 强，范素芳*，张 岩*

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050091）

类固醇激素是一类四环脂肪烃化合物[1-2]，包括天然及人工合成的糖皮质激素、雌激素等[3]，能促进动物超常态生长[4]，加快奶牛的性成熟，提前达到泌乳要求，从而大幅度提高动物养殖经济效益，但这些激素在动物体内较难分解[5-6]，通过食物链进入人体后，会导致机体代谢紊乱、发育异常或存在潜在致癌、致畸风险[7-9]。因此，世界各国对类固醇激素采取禁用或限用措施[10-11]，但动物源性食品中类固醇激素残留问题时有发生，曾一度影响我国动物源性食品的出口量。为保障消费者健康以及我国进出口贸易往来，必须建立灵敏度高、特异性好、可靠的动物源性食品中类固醇激素检测方法，提高监管有效性。

目前，动物源性食品中类固醇激素检测方法主要有高效液相色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13-15]和高效液相色谱-串联质谱法[14-16]。高效液相色谱法灵敏度较差，且无法得到待测物质结构信息，容易出现假阳性结果[17-18]；采用气相色谱-质谱联用法时，待测物需要衍生，耗时较长[19]；高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高，选择性及特异性好，已成为动物源性食品中类固醇激素残留测定的首选方法[20-22]。目前，国内外已有许多激素检测的标准与文献，但大多针对肉制品，乳制品中类固醇激素残留的检测方法较少[23-25]，且前处理步骤多采用传统固相萃取、液-液萃取等，普遍存在步骤繁琐、有机试剂消耗量大等不足[26-28]。本研究采用PRiME HLB固相萃取小柱，可将样品中的脂肪等干扰物吸附在填料内，将目标物过滤到进样瓶中，与传统固相萃取技术相比减少活化、淋洗等步骤，简化了前处理，减少有机溶剂用量。将该技术与高效液相色谱-串联质谱法相结合，建立牛乳和乳粉中氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇和雌三醇4 种类固醇激素的分析方法，采用同位素内标法定量，在提高检测效率的同时保证实验结果的准确性，建立适用于大批量牛乳和乳粉样品中4 种类固醇激素的定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇、雌三醇、氢化可的松-D2（氢化可的松和乙酸氟氢可的松的内标，纯度大于99.0%）、雌二醇-13C2（雌二醇和雌三醇的内标，纯度大于99.0%） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国Merck公司；甲酸（色谱纯） 美国Sigma公司；超纯水 广州屈臣氏有限公司。

1.2 仪器与设备

SCIEX Triple Quad 6500液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾电离源） 美国Sciex公司；CR22N高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；SHA-B恒温水浴振荡摇床 常州润华电器有限公司；Vortex Genius 3旋涡混合器 德国IKA公司；PRiME HLB固相萃取小柱美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

分别称取适量氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇、雌三醇、氢化可的松-D2、雌二醇-13C2标准品至棕色容量瓶中，用甲醇定容，得到质量浓度均为10.0 mg/mL的氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇、雌三醇、氢化可的松-D2、雌二醇-13C2单标储备液，于－20 ℃保存，有效期12 个月。

量取适量氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇、雌三醇、氢化可的松-D2、雌二醇-13C2标准储备液，用甲醇稀释成质量浓度均为10 μg/mL的4 种类固醇激素混合标准中间液和2 种内标混合中间液，于－20 ℃保存，有效期3 个月。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取

称取5 g牛乳或乳粉样品于50 mL具塞离心管中，加入20 μL混合内标中间液，再加入20 mL乙腈（乳粉样品加入5 mL超纯水溶解后再加入20 mL乙腈），涡旋1 min，超声提取20 min，加入5 g氯化钠，混匀，9 500 r/min离心2 min，取上层清液，待净化。

1.3.2.2 净化

取约3 mL上清液，使其通过PRiME HLB固相萃取小柱并弃去滤液；再取1 mL上清液，再次通过PRiME HLB固相萃取小柱并收集流出液，将收集到的流出液过0.22 µm再生纤维素滤膜，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；柱温35 ℃；进样量2.0 μL；流动相A：水，流动相B：乙腈；流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～2.0 0 m i n，流动相B体积分数2 0%；2.0 0～4.5 0 m i n，流动相B体积分数20%～80%；4.50～6.00 min，流动相B体积分数80%；6.00～6.10 min，流动相B体积分数80%～20%；6.10～7.00 min，流动相B体积分数20%。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，负离子模式；扫描方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；离子化电压－4.5 kV；离子源温度550 ℃；气帘气压力30 psi；雾化器压力50 psi；辅助气压力55 psi。4 种类固醇激素定性离子、定量离子对的MRM参数如表1所示。

表1 4 种类固醇激素的MRM参数Table 1 MRM parameters for 4 steroid hormones

1.3.5 结果计算

氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇、雌三醇含量按下式计算。

式中：X为试样中各待测组分含量/（µg/kg）；ρ为根据标准工作曲线计算出的样品溶液中各待测组分质量浓度/（ng/mL）；V为试样溶液最终定容体积/mL；n为试样制备过程中的稀释倍数；m为样品质量/g。

计算结果以重复性条件下获得的2 次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3 位有效数字。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

根据文献[29-31]报道，类固醇激素常用的提取溶剂为叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。本研究考察叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈和甲醇4 种有机溶剂对氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇和雌三醇的提取效果，结果表明：甲醇作为提取溶剂时，提取液较浑浊；乙酸乙酯和叔丁基甲醚作为提取溶剂时，4 种类固醇激素的回收率不及乙腈作为提取溶剂时，且乙腈作为提取溶剂可以很好地去除牛乳和乳粉中的蛋白质，故选择乙腈作为提取溶剂。

PRiME HLB固相萃取小柱可以将牛乳和乳粉中的脂肪等干扰成分去除，延长色谱柱使用寿命，降低基质对仪器的污染，提高检测准确性，且处理过程简单、高效，适用于日常大批量样品的分析检测。

2.2 色谱条件优化

氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇和雌三醇均属于弱极性高分子质量化合物，在C18色谱柱上有较好保留。本研究考察4 种类固醇激素在多种C18色谱柱上的分离效果，包括Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、XBridge BEH Shield RP C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、Thermo AccucoreaQ C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）、Hypersil Gold C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）。结果表明，Wa t e r s A c q u i t y B E H C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）对4 种类固醇激素的分离效果最好。

对比使用不同流动相（甲醇-水、乙腈-水、10 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈）时，4 种类固醇激素的色谱峰峰型和响应情况。结果表明：10 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相时，雌二醇、雌三醇的检测灵敏度降低2～3 倍；乙腈-水体系作为流动相时，色谱峰峰型最佳，故选择该体系作为流动相。

2.3 质谱参数优化

通过流动注射泵连续进样的方式，将质量浓度均为500 ng/mL的氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇、雌三醇、氢化可的松-D2、雌二醇-13C26 种化合物标准溶液以5 μL/min流速直接注入Triple Quad 6500质谱仪中，采用正/负离子模式对目标物进行母离子扫描，对比2 种模式的分离效果。结果表明：氢化可的松和乙酸氟氢可的松在2 种离子模式下的离子峰强度差别不大，而雌二醇和雌三醇在负离子模式下的离子峰强度高于正离子峰模式，这是由于雌二醇和雌三醇含有酚羟基结构，易在负离子模式下获得[M－H]－，故最终确定采用负离子模式。在负离子模式下对目标物进行Q1 MS全扫描，确定母离子，对母离子进行二级扫描，确定定量子离子和定性子离子，再选择MRM模式，优化去簇电压、碰撞能量等质谱参数。优化条件下目标物的MRM色谱图如图1所示。

图1 6 种化合物的MRM色谱图Fig. 1 MRM chromatograms of 6 compounds

2.4 线性关系、检出限和定量限

用乙腈配制一定质量浓度范围的氢化可的松、乙酸氟氢可的松、雌二醇和雌三醇系列标准工作液，氢化可的松质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，乙酸氟氢可的松和雌三醇质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，雌二醇质量浓度分别为1、5、10、20、50、100 ng/mL，内标质量浓度均为10 ng/mL，按优化所得仪器条件进行测定，采用空白基质加标的方法确定方法检出限和定量限，信噪比为3和10时对应的质量浓度分别作为检出限和定量限。

表2 4 种类固醇激素的线性关系、检出限和定量限Table 2 Calibration curve equations, limits of detection and limits of quantification of 4 steroid hormones

由表2可知，4 种类固醇激素在一定质量浓度范围内的相关系数≥0.999，检出限为0.4～2.0 μg/kg，定量限为0.8～4.0 μg/kg。

2.5 加标回收率

表3 4 种类固醇激素的加标回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and precision (RSD) of the 4 steroid hormones from spiked samples (n= 6)

在空白牛乳和乳粉基质中添加4 种类固醇激素进行加标回收率实验，共添加3 个水平，每个水平重复6 次。由表3可知，4 种类固醇激素在牛乳基质中加标回收率为87.7%～110.8%，RSD为0.85%～4.56%，在乳粉基质中加标回收率为89.2%～107.4%，RSD为1.22%～4.22%。

3 结 论

建立通过式固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛乳和乳粉中4 种类固醇激素，样品经乙腈提取后，采用PRiME HLB固相萃取小柱净化，用高效液相色谱-串联质谱结合内标法校正。该方法前处理提取率高，条件易于控制，方法灵敏度高，重复性好，适用于牛乳和乳粉中4 种类固醇激素的检测，也可为其他动物源性食品中其他类固醇激素含量的测定提供参考。