基因组拷贝数变异测序用于高危妊娠胎儿产前诊断的临床价值评估

程龙凤，袁静*，魏兆莲，李琴，周培，张小鹏，陈薇，方慧琴，吴仁花

(1.安徽医科大学第一附属医院妇产科，合肥 230022；2.国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室，合肥 230022；3. 出生人口健康教育部重点实验室，合肥 230022；4.生殖健康与遗传安徽省重点实验室，合肥 230022；5. 安徽省生命资源保存与人工器官工程技术研究中心(安徽医科大学)，合肥 230022)

产前诊断是对高危妊娠胎儿进行先天缺陷和遗传性疾病的诊断，是预防出生缺陷、提高人口素质的主要手段。传统的细胞遗传学方法，如G显带染色体核型分析是染色体病产前诊断的一线方法[1-2]。细胞核型分辨率约为5～10 Mb，但染色体微缺失/重复综合征难以在核型分析中被检测出来[3]。这些染色体微缺失/重复已被确定为许多人类疾病常见病因[4]。而基于下一代测序的基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)可检测出全染色体组非整倍体和100 kb以上的拷贝数变异(CNV)。本研究通过染色体核型分析联合CNV-seq对455 例不同指征的高危妊娠胎儿行产前诊断，同时分析不同指征与染色体异常的关系，比较两种方法对染色体异常的检出率，探讨CNV-seq在临床产前诊断中的应用价值。

资料与方法

一、研究对象

收集2018 年1～12 月在安徽医科大学第一附属医院产前诊断中心就诊并接受侵入性产前诊断的高危妊娠孕妇临床资料，根据不同孕周选择羊膜腔穿刺术或脐静脉穿刺术，羊水或脐血样本同时送检染色体核型分析和CNV-seq检测。最终入组455 例，孕妇年龄18～49 岁，孕周为18～33 周。所有孕妇在侵入性产前诊断前均接受产前诊断咨询并充分告知其穿刺相关风险、染色体核型分析和CNV-seq各自的检测范围和局限性后，签署穿刺术及检测知情同意书。

二、不同指征的定义及分类

根据不同的产前诊断指征，将高危妊娠胎儿分为以下两类：(1)非超声相关高危组：包括高龄(孕妇年龄≥35 周岁，包括分娩时满35 周岁)、血清学筛查高风险、NIPT高风险、不良妊娠史以及其他；(2)超声相关高危组：包括超声软指标异常和明确的胎儿超声结构异常。

三、方法

羊水/脐血管穿刺术：孕18～23 周孕妇行羊水穿刺术，孕26～33 周孕妇行脐带穿刺术。具体方法如下：超声引导下进行羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺术，取羊水约25 ml，其中20 ml行染色体核型分析(320 条带)，5 ml用于CNV-seq检测。脐血3.5 ml，其中1.5 ml送检染色体核型分析，2 ml用于CNV-seq。

G显带染色体核型分析：20 ml羊水样本离心7 min，吸上清，留取1 ml脱落上皮细胞，加入培养基(广州辉达)3.5 ml至培养瓶。培养12 d，观察其细胞克隆情况，换液，第2或3天观察是否收获。胰酶消化2.5 min，1 500 rpm离心7 min，弃上清，低渗，固定后滴片。80℃烤箱烘烤2.5 h，采用G显带处理。1.5 ml脐血接种于淋巴细胞培养基(广州辉达)中，培养72 h，加入秋水仙素，2.5 h后收获，1 500 rpm离心7 min后处理同前。显微镜下计数，分析10个核型，嵌合体加倍计数。

CNV-seq检测：提取羊水中脱落细胞或脐血细胞基因组DNA，将50 ng全基因组DNA使用限制性内切酶水解，获得平均大小为200 bp的DNA片段，采用PCR-free建库方法进行文库制备(杭州贝瑞基因)。在NextSeq CN500 高通量测序平台(杭州贝瑞基因)，36 bp单端测序，测序深度0.1×。所有测定序列，通过检索DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed等数据库进行CNV临床意义的确定。

四、统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数和标准差表示，计数资料以频数和构成比表示。

结 果

一、G显带染色体核型分析与CNV-seq检测结果

1.G显带染色体核型分析：在455 例产前诊断的孕妇中，共检出染色体异常22例，阳性率为4.83%(22/455)。其中，非整倍体17例(其中21-三体9例，18-三体5例，性染色体非整倍体3例)，微缺失2例，微重复2例，嵌合体1例。染色体多态5例(均为9号染色体臂间倒位)。

2.CNV-seq：CNV-seq共检出异常42例，阳性率为9.23%(42/455)。其中致病性异常31 例，可能致病性异常11例。致病性异常中非整倍体17例、微重复4例、微缺失5例、微缺失合并微重复3例、嵌合体2例；可能致病性异常中微重复4例、微缺失6例、嵌合体1例(表1，表2)。

二、非超声相关高危组染色体核型分析及其对应CNV-seq结果异常的情况

在非超声异常高危妊娠胎儿中染色体核型分析检出异常10例。CNV-seq检测出致病性异常14例，可能致病性异常8例。

其中，NIPT高危孕妇染色体核型检出异常8例，CNV-seq检出致病性异常9例，可能致病性异常1例。不良妊娠史孕妇染色体核型未检出明显异常，CNV-seq检出致病性异常2例，可能致病性异常2例。高龄孕妇染色体核型检出异常2例，CNV-seq检出致病性异常2例，可能致病性异常3例。余指标染色体核型未检出明显异常，CNV-seq检出致病性异常1例，可能致病性异常2例(表1)。

三、超声相关高危组染色体核型分析及其对应CNV-seq结果异常的情况

超声相关的高危孕妇胎儿中染色体核型分析检出12例异常，CNV-seq共检出17例致病性异常，3例可能致病性异常(表2)。

表1 非超声相关高危组染色体核型分析及其对应CNV-seq结果异常

表2 超声相关高危组染色体核型分析及其对应CNV-seq结果异常

讨 论

出生缺陷主要原因之一为染色体病和基因组病[5]，且目前尚无有效治疗手段。核型分析技术对染色体数目以及结构异常的诊断可靠准确，经济实惠，是染色体异常产前诊断的金标准被广泛应用。但是G显带染色体核型分析只可检测>5 Mb的染色体片段异常，无法辨别微小变异的缺失/重复，且对于临床潜在风险的认知有限[6-7]。CNV-seq检测通过在下一代测序平台(NGS)对全基因组范围内检测>100 kb的染色体拷贝数变异(缺失/重复)，以及染色体非整倍体，并通过检索数据库进行分析其是否为异常。染色体的微缺失/微重复是胎儿致畸或智力低下等发育异常的重要原因之一[8-10]。本研究使用G显带染色体核型分析和CNV-seq检测两种方法，回顾性分析了455例有产前诊断指征的高危妊娠孕妇胎儿染色体异常情况，比较了两种检测方法染色体异常检出率，并分析了不同产前诊断指征的染色体异常情况。

有研究表明，CNV-seq检测对染色体检查的准确性与传统的核型分析相当且分辨率更高[11-12]。本研究中，G显带染色体核型分析总的异常检出率为4.83%，CNV-seq总检出率为9.23%，CNV-seq较传统的细胞遗传学检测可多检出4.4%异常。与之结果一致，说明CNV-seq可以提高染色体异常检出率，进而为临床上产前诊断及遗传咨询提供更多依据。

在染色体异常中，核型分析检出非整倍体17例，CNV-seq与之检测结果一致。核型分析检出微缺失2例，微重复2例。经CNV-seq验证，此4例染色体片段异常均为致病性异常，CNV-seq相对精准的定位了异常片段及其大小，对于解读这些区域内包含的功能基因有益。倒位5例，均为9号染色体臂间倒位，其中CNV-seq检测4例提示结果正常，另1例检测到11号染色体片段重复，与核型分析提示的9号染色体倒位并不一致，说明CNV-seq检测技术具有局限性，即无法检测出染色体倒位变异，推论亦无法检测平衡易位这类结构变异，也说明了核型分析即使对于相对较大的片段仍有漏诊的可能性。此外，染色体核型分析检出嵌合1例。有研究表明，CNV-seq技术可以检测到低比例的嵌合体，在理想条件下可检测低至5%的染色体非整倍体嵌合[13-14]，在临床样本中可发现超过10%的染色体非整倍体嵌合[15]。本研究细胞学检测出的嵌合体核型为45，XO/46，XN经验证为45，X[50%]/46，XY[50%]的嵌合体。另有2例染色体核型未见明显异常，而CNV-seq检测出嵌合情况，并给出嵌合比例。比较而言，CNV-seq对嵌合体的诊断较传统的细胞学检测有更高的准确性，可为临床遗传咨询提供更多解读依据。

本研究将高危妊娠孕妇分为非超声异常高危组和超声异常高危组。其中，非超声异常包括高龄、血清学筛查高风险、NIPT高风险、不良妊娠史，以及其他。对于超声异常的高危孕妇分为超声软指标异常以及明确的胎儿超声结构异常。超声软指标并不能完全提示胎儿的结构发育异常，可能是一种正常的变异[16]。有研究表明，在超声提示胎儿结构异常而染色体未见明显异常的胎儿中，有6%～7%存在致病或可疑致病性异常的CNVs[17]。本研究中超声相关的高危孕妇中，CNV-seq共检出17例致病性异常，其中8例为染色体非整倍体，与染色体核型分析结果一致。在超声提示软指标或结构异常而核型分析未见明显异常的胎儿中，CNV-seq检测出5例致病性异常，3例可能致病性异常。其中包括1例22q11微缺失综合征，1例22q11微重复综合征，1例小儿巨脑畸形综合征合并过度生长综合征，1例2q33.1微缺失综合征，1例角膜营养不良综合征。我们认为，规范的产前诊断超声检查可发现胎儿微小的结构异常，染色体核型分析有漏诊的可能性，而使用CNV-seq可提高染色体亚显微结构上的异常检出率。

综上所述，本研究通过联合应用G显带染色体核型分析和CNV-seq检测技术，比较了二者对不同染色体异常检出的优势和局限性，分析了不同高危产前诊断指征与染色体异常的关系，认为二者联合检测可提高临床产前诊断的准确性，尤其对于多指标异常的高危孕妇，可有效预防出生缺陷。但本文也有不足之处，超声相关产前诊断指征有待于分类分析以及对胎儿出生后的进一步随访验证。我国2019年4月发表专家共识认为有产前诊断条件的单位可将CNV-seq作为一线产前诊断技术应用于临床[18]。然而致病性未知的CNV-seq检测结果以及因部分CNV导致的疾病存在表现度与外显率的差异，受限于目前医学对疾病的认知，也给临床咨询带来不确定性，也使得患者及家庭产生不必要焦虑的心理，同时对医学伦理带来挑战。因此，应充分告知孕妇CNV-seq技术的适用范围与局限性，使其在充分知情的前提下自主选择。