棉花杂交种种子纯度的SSR分子标记鉴定方法

(石河子大学农学院，新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆 石河子 832003)

棉花是关系我国国计民生的重要战略物资和纺织工业的重要原料，在农业生产和国内生产总值中占有重要地位。随着现代农业生物技术的进步及农作物产业结构的逐步调整，棉花总产及单产逐年提高。目前，我国已成为世界第一大棉花生产国和消费国。

近年来，随着棉花杂交育种工作的逐步推进，杂种优势表现明显。棉花杂交种子的市场缺口和较高的经济利润，使棉花种子市场掺假、套牌等现象屡禁不止。若不能及时有效地鉴定杂交棉的纯度，势必给棉农带来严重的经济损失。加之，棉花育种中骨干亲本的频繁使用与转基因技术的运用，缩小了棉花品种间的差异，使不同品种的形态差异表现不明显，难以通过感官识别。因此，棉花杂交种纯度的快速鉴定显得至关重要。

传统棉花杂交种纯度鉴定是通过田间性状的识别而进行的，费时，费力，时效性差，且容易受环境与人为因素的影响。而简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)分子标记具有特异性好、共显性、灵敏性和准确性高，且不受环境因素的影响等优点，已被广泛应用到作物种子的纯度、真实性鉴定和遗传多样性分析等方面。

武耀廷等[1]对30个棉花栽培品种和4个杂交种亲本进行真实性鉴定，发现有4个标记可区分杂交种。白静等[2]筛选出56对核心SSR引物对生产上推广的37个棉花杂交种进行检测，可以将37个品种完全区分开。符家平等[3]用8对核心SSR引物构建了棉花杂交种C 111的指纹图谱。刘国栋[4]运用SSR引物对51个常规棉品种进行纯度鉴定、遗传聚类分析和品种特异性鉴定等。王飞等[5]采用52对SSR核心引物对7个棉花常规种进行分析，并能够准确鉴定品种纯度。许兰杰等[6]利用棉花杂交种兴杂2号的亲本筛选出一些多态性SSR引物，并利用这些引物快速检测兴杂2号种子纯度。王欣怡等[7]利用SSR分子标记技术对120份棉花材料棉花品种真实性和纯度进行研究，筛选出26对核心标记，其纯度检测结果与田间纯度鉴定呈现正相关性。近年来，分子标记检测技术已被广泛应用于植物种子纯度检测，利用共显性SSR标记对待测样品进行检测，通过带型差异，检测杂种，如水稻[8]、玉米[9]、小麦[10]、大豆[11]，马铃薯[12]、黄瓜[13]、油菜[14]、辣椒[15]、茄子[16]、西瓜[17]等都已开展了相关研究工作。

本研究利用SSR分子标记对4个杂交种纯度进行鉴定，对杂交棉纯度鉴定选用引物的数量进行了探讨，为今后快速鉴定棉花杂交种纯度提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料：杂交组合P 1/P 2、P 3/P 4、P 3/P 5、P 6/P 5共4个组合的杂交种及其亲本。杂交种材料均由石河子大学棉花所提供。

1.2 基因组DNA提取

参照Horn等[18]和匡猛等[19]的SDS提取法并加以改进，提取棉花种子的DNA并纯化。用Nanodrop 1000紫外分光光度计检测DNA样品浓度和质量。1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，DNA浓度统一稀释到200～300 ng·μL-1之间。

1.3 SSR引物

SSR引物序列来源于棉花基因组数据库Cottongen(https://www.cottongen.org/)，前期实验筛选出多态性好、重复性高的163对引物。引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.4 微卫星的PCR扩增与银染分析

PCR反应体系：10×Buffer(含Mg2+)2.0μL、DNA模板(50 ng·μL-1)2.0μL、dNTP(2.5 mM)1.6μL、上引物(1.0μM·μL-1)1.0μL、下引物(1.0μM·μL-1)1.0μL、Taq酶(2.5 U·μL-1)0.2μL，最后用ddH2O补足到20.0μL体系。反应扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50～ 60 ℃(视引物而定)退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acrylamide∶Bisacrylamide=37.5∶1；Ammonium persulfate,APS；TEMED)电泳，电泳缓冲液为1×TBE，160 V恒压(电泳仪：EPS-301)下电泳2 h检测。

银染检测：固定液(10% C2H5OH，0.5%CH3COOH)固定8 min，0.2% AgNO3溶液染色10 min，去离子水水洗1 min，显影液(1.5% NaOH，0.4% HCHO)显色，去离子水冲洗30 s。用扫描仪扫描或相机拍照并记录带型。

1.5 纯度判别方法

筛选出双亲间具有多态性的共显性SSR引物，对杂交种进行纯度鉴定。根据杂交种SSR扩增产物的电泳带型差异，测算父本、母本和其他杂种种子数占被测种子数的百分率。每粒种子在2对及以上检测引物中扩增带型与普带或标准带型不一致时，判定其为杂株。

注：M为Marker DS 2000； M 1，M 2为母本，父本；1～20为杂交种样品编号；白色箭头为多态性片段。下同。图1 引物SWU 1259和CIR 246对P 1/P 2的杂交种纯度检测

图2 引物SWU 1259和NAU 2277对P 3/P 4的杂交种纯度检测

表2 4个杂交组合种子纯度检测

2 结果与分析

2.1 杂交组合引物筛选

经过筛选，在P 1/P 2亲本间表现多态性的引物有NAU 3254、CIR 246、SWU 1259、NAU 943、NAU 432；在P 3/P 4亲本间表现多态性的引物有BNL 1026、NAU 2277、NAU 3110、NAU 3277、SWU 1259、NAU 1167、NAU 1413；在P 3/P 5亲本间表现多态性的引物有NAU 1042、NAU 1255、NAU 2277、NAU 3254、SWU 1259、CIR 246；在P 6/P 5亲本间表现多态性的引物有HAU 2026、SWU 1259、NAU 2173。

2.2 杂交种纯度检测

经过筛选，4个杂交组合各筛出3～7对共显性多态性引物，可以用来检测杂交种的纯度。用5对引物检测P 1/P 2的20个杂交种，发现引物NAU 943、HAU 432、SWU 1259分别检测出9个相同的杂株，鉴定样品纯度为55%(图1，表2)。用7对引物对20株P 3/P 4的杂交种进行检测，引物SWU 1259、NAU 1167、NAU 1413分别检测出相同的5个杂株，具有母本带型，P 3/P 4杂交种的纯度为75%(图2，表2)。用6对引物对20株P 3/P 5的杂交种进行检测，只有CIR 246检测出2株具有母本带型，其他引物均未检测出杂株，依据纯度判别方法，鉴定样品纯度为100%(图3，表2)。用HAU 2026、NAU 2173、SWU 1259引物对20株P 6/P 5的杂交种进行检测，共检测出8个植株具有母本带型。其中SWU 1259引物检测出1个，NAU 2173引物检测出8个，HAU 2026引物未检测出，鉴定样品纯度取平均值为85%(图4，表2)。

图3 引物SWU 1259和CIR 246对P 3/P 5的杂交种纯度检测

图4 引物SWU 1259和NAU 2173对P 6/P 5的杂交种纯度检测

3 讨 论

近年来，分子标记技术的飞速发展，涌现出许多简便有效的方法用于杂交种纯度及真实性检测等方面，姚丹青等[20]应用高分辨率熔解曲线技术对黄瓜纯度及品种SNP位点进行检测。结果表明，对供试样品同时进行6个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的检测分析，能够更加准确、高效地鉴定其纯度。胡俏强等[21]利用插入缺失(insertion-deletion，InDel)共显性分子标记对4个糯玉米杂交种进行了纯度分析，结果显示，InDel标记鉴定结果与田间鉴定结果呈极显著正相关，可用于糯玉米杂交种纯度鉴定。杨双娟等[22]利用InDel分子标记技术对结球甘蓝“豫甘3号”杂交种进行了纯度快速鉴定，从395对InDel引物中筛选出6对具有双亲互补条带、差异明显的引物用于结球甘蓝“豫甘3号”种子纯度的快速鉴定。樊悦等通过竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)对188个花生品系进行了基因型检测[23]。本研究采用SSR分子标记对4个杂交种进行纯度鉴定，发现引物SWU 1259能够用于4个杂交种纯度鉴定，并且在杂交种的双亲间都呈共显性，引物NAU 2277可以同时鉴定杂交组合P 3/P 4和P 3/P 5，引物NAU 3254和CIR 246都能鉴定杂交组合P 3/P 5和P 1/P 2。在种子纯度检测中，多态性高的引物具有更好的通用性，本研究中筛选出的16对SSR引物多态性都较高，可广泛用于棉花种子纯度及真实性检测。

本研究中，对杂交组合P 1/P 2的种子检测，引物NAU 943、HAU 432、SWU 1259所检测出的异株编号为1、3、4、8、9、12、15、16、18，而引物NAU 3254、CIR 246却未检测出编号为4、8、18的异株(图1)。对杂交组合P 3/P 4的种子检测中，引物SWU 1259、NAU 1167、NAU 1413所检测出的编号为1、3、18、19、20，而引物BNL 1026、NAU 2277、NAU 3110、NAU 3277却未检测出上述异株(图2)。对杂交组合P 3/P 5的种子检测中，引物CIR 246所检测出的异株编号为2、14，而引物NAU 1042、NAU 1255、NAU 2277、NAU 3254、SWU 1259都未检测出编号为2、14的异株(图3)。对P 6/P 5的种子检测中，引物NAU 2173、SWU 1259所检测出的异株编号不尽相同，但引物HAU 2026却未能检测出异株(图4)。这可能是由于棉花是常异花作物，亲本自身部分位点不纯，导致杂交种不纯，造成用不同引物检测出的异株有出入。因此，在进行棉花杂交种种子纯度鉴定时，应选取尽可能多的引物数量进行检测，以保证检测结果的准确性。考虑成本及检测周期，至少应选取3对及以上引物进行检测，在2对引物中检测纯度一致时，结果相对可靠，若在3对引物中的结果均不一致，可取平均值计算，或进一步增加检测的引物数量。

在杂交棉种子生产过程中，为保证杂种一代的一致性，应尽可能增加亲本自交代数，严格进行杂交种的分子标记纯度检测，保障种子纯度，提高产量、增加收益。