山羊传染性胸膜肺炎免疫学诊断方法的研究进展

吴娅琴，颜新敏，郝华芳，陈胜利，马丽娜，储岳峰

(中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)引起山羊的一种严重的呼吸道疾病，被世界动物组织(OIE)列为法定报告动物传染病之一。超急性病例出现轻微症状后1～3 d死亡；急性病例表现为高烧(41～43℃)，剧烈频繁的咳嗽，一般在7～10 d内死亡。新发疫区发病率达60%，死亡率90%[1]。老疫区常呈慢性发病经过，主要表现为长期咳嗽和消瘦。急性和亚急性疾病剖检变化特征是单边浆液纤维素性胸膜肺炎并伴有严重的胸腔积液[2]。

CCPP病原不易分离，1873年，CCPP在阿尔及利亚被首次报道[3]，但直到1976年，Mccp才首次在肯尼亚被分离并证明是CCPP病原体[4]。目前报道来看，其流行区域主要分布在亚洲、中东和非洲40多个国家，但分离到病原的只有16个国家[5]。CCPP在我国历史悠久，1922年新疆伊犁发生山羊“烂肺病”，1958年研制成功组织灭活疫苗并较好地控制了本病的流行；但2007年，我国再次从临床分离到Mccp[6]，随后储岳峰等[7]、郭晗等[8]、刘波等[9]和YU等[10]分别从西北地区、内蒙古和西藏地区分离到Mccp，表明CCPP在我国卷土重来并危害到野生羊，不容忽视。

准确诊断是制定疫病有效防控措施的重要技术环节，然而，CCPP常与其他呼吸道感染混淆，如由丝状支原体簇其他部分成员引起的肺炎。尽管有通过超声波图像显示胸部病变特征结合临床的诊断报道[11]，但CCPP临床症状并不具有特征性，确诊须实验室方法，如病原学诊断、分子生物学检测和血清学诊断等。其中，由于Mccp分离培养困难、分离率极低且耗时长，虽是经典确诊CCPP方法，具备分离鉴定Mccp能力的实验室并不多。因此常用分子方法和血清学方法进行快速检测实现辅助诊断、流行病学调查以及免疫监测等，本实验室目前正在开展这两方面的工作[12]，本文对CCPP常用血清学抗原抗体诊断方法、Mccp单抗以及诊断靶标进行总结，分析其优缺点并进行展望，以期为下一步研究提供思路。

1 抗原诊断方法

1.1 凝胶沉淀试验(GPT)以Mccp分泌多糖制备的单抗WM25识别样品中的Mccp多糖进而产生沉淀反应，该单抗也可用与Mccp多糖发生凝胶沉淀反应的山羊康复血清(含有IgM)代替[13]。这种方法尤其适用于存放时间过长或运输不当造成变质的样品。但凝胶沉淀试验不够特异，与丝状支原体簇其他成员尤其李奇支原体会发生交叉反应[14]。

1.2 乳胶凝集试验(LAT)MARCH等[15]开发了一种识别Mccp荚膜多糖的LAT，用抗Mccp多克隆血清包被乳胶颗粒，该方法可用于快速检测Mccp。检测田间血清时，与补体结合反应(CFT)相比，一致性为67%；这种方法极大提高了敏感性，最低能检测出0.03 mL 血清里2 ng的荚膜多糖(1.7×104CFU)；但是与李奇支原体也存在交叉反应。因敏感性高，且检测的是病原本身，适用于CCPP的早期诊断。

1.3 生长抑制试验( GIT)GIT原理是高免血清直接抑制培养基中Mccp生长。使用多克隆抗血清时，Mccp与李奇支原体PG50、生殖支原体和类人猿支原体有交叉反应。RURANGIRWA等[13]筛选到1株单克隆抗体WM25，基于WM25建立的圆盘生长抑制法，可以将Mccp与无乳支原体、山羊支原体山羊亚种和丝状支原体簇中其他山羊支原体区分开，但不能区分李奇支原体。RURANGIRWA等[16]又筛选到1株单抗E8-18，但不抑制Mccp体外生长，因此不能用于GIT。GIT常用于鉴定Mccp培养物。

1.4 免疫荧光试验(FAT)直接和间接FAT对于鉴定大多数支原体来说是最有效的血清学方法。RURANGIRWA等[13]依赖单抗WM25建立一种菌落免疫荧光检测方法，虽与山羊支原体山羊亚种有交叉反应，但可以区分李奇支原体，若是结合WM25生长抑制法可实现Mccp的鉴定。但当使用兔高免血清时，对于Mccp是非特异性的。FAT常用于鉴定Mccp培养物，也可用于组织样本中Mccp抗原的检测。

2 抗体诊断方法

2.1 补体结合试验(CFT)CFT目前是国际贸易指定的CCPP检疫试验。以Mccp F38菌株超声后的上清作为抗原[17-18]。大多数支原体，尤其是属于丝状支原体簇的其他支原体，在CFT中会有交叉反应，所以在无CCPP的国家或地区发现CFT阳性时，应该追加其他的检测来确定。可疑血清应用丝状支原体簇其他几种支原体抗原同时检测，尤其是山羊支原体山羊亚种和李奇支原体。CFT在CCPP的血清学诊断中最为广泛，缺点是会出现交叉反应，敏感性较低，而且不同实验室制备的抗原存在差异，一致性不高。

2.2 间接血凝试验(IHA)IHA是最早用于检测Mccp抗体的血清学方法之一，在无乳支原体和牛生殖道支原体检测中也有应用，其抗原稳定性可以保持7个月[19]。IHA是目前我国获得新兽药证书的CCPP抗体检测方法，也是CCPP新灭活疫苗的替代检验方法。我国建立的IHA方法以Mccp分泌多糖为抗原致敏绵羊红细胞为基础，用丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、溶血性曼氏杆菌及猪肺炎支原体的阳性血清对该方法进行特异性评估，结果均为阴性，显示出较好的特异性[20]。间接血凝方法灵敏度、特异性较高，方法简单、快速，可用于Mccp的血清学诊断及流行病学调查，冻干抗原可保存5年以上。但由于载体红细胞可能因供体个体及制备批次的差异，对其批次稳定性有一定影响。潜在的问题还包括用Mccp多糖抗原作为诊断靶标可能存在特异性不足，根据BERTIN等[21]对丝状支原体簇成员多糖编码基因及其产物结构的分析，Mccp多糖检测抗体或可能与李奇支原体和山羊支原体山羊亚种发生交叉反应，不同菌株间也可能有一定的差别。

2.3 乳胶凝集试验(LAT)通过Mccp模式菌株F38产生的多糖致敏乳胶颗粒，若血液中有Mccp抗体，则会发生血凝现象[22-23]。经验证，多糖致敏的乳胶颗粒与丝状支原体丝状亚种大菌落型、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种、精氨酸支原体和结膜支原体血清反应结果均为阴性，表现出了良好的种特异性。而且LAT比酶联免疫吸附试验(ELISA)和CFT都易于操作[23]：只需1滴全血，在玻片上就可以进行，结果肉眼可见，检测成本较低。但是，产生与Mccp多糖相似的其他支原体(如李奇支原体)或是某些细菌都可能发生交叉反应。

2.4 ELISA试验1994年， THIAUCOURT等[24]建立了1种阻断酶联免疫方法(B-ELISA)，由Mccp模式菌株F38得到的单克隆抗体4.52作为阻断抗体，但敏感性不高。法国国际研发农业研究中心(CIRAD)基于这种B-ELISA改善成1种C-ELISA[25]，具有高度的特异性(99.8%～100.0%)[26]。通过一项国际合作研究，确认了该C-ELISA方法在非洲、亚洲以及中东国家应用效果[5]，该方法目前已开发成商业化试剂盒。WANBUGU等[27]于2005年开发了一种I-ELISA，利用一种特异的Mccp荚膜多糖表位作为包被抗原，比基于相似抗原的LAT有更好的诊断效果。已有报道对LAT、I-ELISA和C-ELISA进行了对比评估，共325例样品，LAT检测出53份阳性，I-ELISA检测出64份阳性，C-ELISA检测出38份阳性[28]。以这些结果来看，LAT和ELSIA都可以用于常规血清学检测，LAT适用于田间检测，其敏感性与特异性和ELISA相当；然而，就实验室诊断来说，ELISA相比于其他的方法来说具有更好的敏感性或特异性。

ELISA可用于监测畜群状态、疫苗免疫水平、病例确诊以及流行病学调查。但在急性病程中，血清学还未反应出抗体的变化，宿主就已经死亡，所以说其更适用于群体而非个体的诊断。基于单抗的C-ELISA与CFT相比，其敏感性较高、特异性强，可避免同丝状支原体簇的其他支原体发生交叉反应；其次，C-ELISA也可用来评价CCPP疫苗的质量，但其滴度和保护之间的关系还不明确[5]。实际上，因为涉及到成本，C-ELISA并未被广泛使用[29]。

3 单抗

由于Mccp属于丝状支原体簇成员之一，成员间存在高度的抗原及遗传相似性，因此CCPP的诊断方法要求较高的特异性，单抗是最佳选择之一。国外已报道针对Mccp的单抗包括WM25[13,30]、E8-18[16]和4.52[5,24]。其中，基于WM25建立生长抑制法和菌落免疫荧光法，生长抑制试验中与李奇支原体存在交叉反应，菌落免疫荧光试验与山羊支原体山羊亚种交叉反应，但可将两者结合起来对Mccp进行鉴定。基于单抗4.52建立的C-ELISA方法，已被IDEXX开发成商品化试剂盒，具有较高的特异性、灵敏性和稳定性。单抗E8-18虽然能识别Mccp上特有的膜蛋白P24，但其不具有生长抑制特性；而基于E8-18建立的阻断ELISA结果显示试验感染的山羊血清不能阻断单抗与Mccp抗原结合。另外，本实验室前期也筛选到5株单抗，但与绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种PG3和牛支原体08M存在不同程度的交叉反应[31]。

4 特异性抗原靶标筛选

决定免疫学诊断方法特异性和敏感性的另一关键是抗原靶标。随着基因组测序的快速发展，部分Mccp菌株的完整基因组序列已被解析。CHEN等[32]对M1601进行了全基因组分析，其基因组大小为1 016 707 bp，GC含量为23.67%，编码915个基因，其中713个蛋白编码基因，包括26个潜在毒力因子，表明可能被宿主免疫系统识别，作为潜在的血清学诊断靶标。最近，LI等[33]对Mccp不同分离株及丝状支原体簇成员之间进行比较基因组分析，得到183个Mccp区别于其他山羊源支原体的特异性基因，以及一些与宿主特异性有关的毒力因子，但文章中并未提供相关基因和毒力因子的完整信息。

从蛋白水平上进行靶标筛选也进行了一定的工作，MARCH等[34]报道的IgG免疫印迹试验中，试验感染血清和25份田间血清均在44 000，40 000和23 000处出现条带。大多数血清中观察到108 000，70 000和62 000条带。这些“核心”免疫显性蛋白(在阴性血清中未能识别)可能是表达重组蛋白作为筛选诊断靶标的基础。CHRUCHWARD等[35]通过2D电泳质谱分析以及Western blot比较蛋白组学方法得到丝状支原体山羊亚种6个候选诊断蛋白，这些蛋白包括丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸甘氨酸激酶、吡啶-核苷磷酸酶、30S核糖体蛋白S6和二磷酸三乙酯和酰胺乙酰转移酶。另外本实验室还发现Mccp GH2株外膜蛋白中相对分子质量大约为60 000 和49 700的蛋白可能是其区别于丝状支原体山羊亚种PG3株和绵羊肺炎支原体Y98株的主要特异性抗原[36]。

5 讨 论

目前免疫学检测除了上述常用的方法外，还报道了反向血凝实验(PHT)[37]、玻片凝集试验(SAT)[38]和交叉免疫电泳(CIE)[39]。然而，目前已有的免疫学检测方法存在包括非特异性、实验室仪器设备要求成本高和不易操作等缺点，给CCPP的诊断造成了困难。

已知全世界范围内超过40个国家受到Mccp影响，对全世界的养羊业都是一个威胁，血清学抗体检测能较好地反应宿主感染状态或免疫状态，因此是CCPP防控不可或缺的技术环节。鉴于目前CCPP抗体检测方法存在的问题，期望筛选出更特异的诊断靶标，进而从田间实用性以及成本方面考虑，建立实用、低成本或高通量的血清学抗体诊断方法。目前，本实验室采用比较基因组、比较蛋白组学和单抗筛选等方法，在诊断靶标筛选方面进行了一些探索，如用Mccp1601菌株的全基因组蛋白编码序列与丝状支原体簇内的其他支原体基因组序列进行比较，得到了部分Mccp1601特异性地蛋白编码基因序列，下一步将从这些编码序列中筛选出Mccp共有的蛋白作为潜在抗原靶标进行鉴定；同时，以Mccp菌体蛋白及其膜蛋白做二维电泳，用Mccp及丝状支原体簇成员的免疫血清进行免疫印迹筛选差异免疫原；另外，用常见反刍动物支原体菌株抗原反向筛选Mccp单抗等，以期通过上述工作能够筛选鉴定到Mccp特异性诊断靶标，继而建立Mccp抗体的快速或高通量检测技术，为CCPP防控提供可靠的技术手段。