塞来昔布联合运动干预对人结肠癌小鼠移植瘤的影响及其机制

赵玉琛，韩娟娟，张新安

（1.中国医科大学体育部，沈阳 110122；2.沈阳体育学院运动人体科学学院运动生理生化教研室，沈阳 110102）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的重要原因［1］。目前，CRC的主要治疗方式为手术、放射治疗和化学治疗［2］。塞来昔布是一种高选择性环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂，为新型非甾体抗炎药，是治疗CRC的重要药物［3-5］。

血管生成在肿瘤的发生、发展过程中至关重要，抑制血管生成是一种有效的癌症治疗手段［6］。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD105均为重要的血管生成因子，与CRC浸润转移关系密切［6］。肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）是反映血管生成的可靠指标，与肿瘤的生长浸润和转移密切相关［7］。CD105抗体标记的MVD是判断CRC血管生成的有效指标［8］。

研究［9-11］证实，运动锻炼与癌症的发生、发展及肿瘤细胞的增殖扩散密切相关，运动可通过调节代谢、性激素水平、免疫抑制和炎症反应等途径抑制CRC生长转移，降低肿瘤复发率和死亡率。近年来，对癌症患者在药物治疗的基础上联合运动干预取得了较好的临床疗效［12-13］。本研究拟通过塞来昔布联合运动干预人结肠癌移植瘤小鼠，探讨药物联合运动干预对人结肠癌移植瘤小鼠生存率及移植瘤生长相关因子的影响及其机制，为CRC的防治策略提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 建模

雌性BALB/c小鼠90只，4～5周龄，体质量15～20 g，购自中国医科大学动物中心［许可证号：SCXK（辽）2017-0001］。于无特定病原体环境的层流架中使用无菌饲料及灭菌纯净水饲养。造模前，所有小鼠先进行为期1周的适应性跑台训练，环境温度（26±2）℃，光照周期12∶12，湿度55%±4%。

人结肠癌细胞株HT-29购自中国科学院（上海）细胞库，小牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶购自美国Hyclon公司。用含10%新生牛血清、100 U/mL青链霉素的DMEM/F12培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养HT-29细胞。胰蛋白酶消化并传代后，制成细胞悬液。小鼠跑台适应性训练后24 h，于颈背部皮下接种上述细胞悬液0.2 mL。本研究严格按照国际伦理指南和美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南进行，并获得中国医科大学伦理委员会批准。

1.2 分组及干预方案

建模过程中，定期用游标卡尺测量移植瘤长径。移植瘤最大直径达5 mm（细胞种植15 d）时，开始进行药物及运动干预。选取移植瘤直径误差2 mm以内的80只小鼠，并随机分为A、B组，每组40只。2组再分别随机分为4组：（1）肿瘤对照（Ca）组，每天给予灭菌蒸馏水灌胃；（2）跑台运动（TE）组；（3）塞来昔布（Ce）组，给予塞来昔布（日本辉瑞制药公司）50 mg·kg-1·d-1灌胃；（4）跑台运动+塞来昔布（TE+Ce）组，每天跑台运动后塞来昔布灌胃。每天记录A组小鼠的死亡情况，直至全部死亡，分析生存情况。B组于干预5周后，静脉穿刺抽血，处死所有存活小鼠，分离肿瘤组织冷藏备用，用于测定血清TGF-β1、VEGF水平、肿瘤组织CD105标记的MVD以及肿瘤体积变化情况。肿瘤体积估算公式：V=ab2/2。其中，a为长径，b为短径。

1.3 血清TGF-β1及VEGF测定

取小鼠血样，于4℃下，800 r/min离心30 min，3 000 r/min离心10 min，收集血清，-80 ℃保存待测。按照TGF-β1酶联免疫吸附试剂盒（武汉博士德公司）及VEGF酶联免疫吸附试剂盒（R&D Systems公司）说明，检测血清TGF-β1、VEGF水平。

1.4 小鼠移植瘤组织CD105标记的MVD计数

采用免疫染色法测量CD105标记的MVD。制移植瘤组织切片（厚度5 μm），常规脱蜡，孵育浸泡冲洗，用胰蛋白酶暴露胞内抗原，滴加一抗（鼠抗人CD105单克隆抗体），PBS冲洗，滴加二抗（羊抗鼠IgG抗体），脱水封固。血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性染色。低倍（×10）视野下选取5个新生血管最密集区域，在高倍（×400）视野下观察计数血管（单个棕色细胞或细胞丛为1个血管），计算血管均数。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 跑台运动和塞来昔布对人结肠癌小鼠生存率的影响

经过63 d塞来昔布和跑台运动干预，小鼠生存率变化曲线如图1所示，TE+Ce组生存率明显高于其他组，与Ca组相比有统计学差异（P＜ 0.01）。提示单一塞来昔布、单一运动、塞来昔布联合运动干预均可延长人结肠癌小鼠的生存时间，提高其生存率，而塞来昔布联合运动干预效果最显著。

2.2 塞来昔布和跑台运动对人结肠癌小鼠移植瘤体积的影响

经过35 d的塞来昔布和跑台运动干预，如图2所示，TE组、Ce组、TE+Ce组小鼠移植瘤体积均显著小于Ca组（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.01）；TE+Ce组移植瘤体积小于TE组和Ce组（均P＜ 0.01）。提示单一塞来昔布、单一运动干预、塞来昔布联合运动干预均可抑制人结肠癌小鼠移植瘤生长，而塞来昔布联合运动干预效果最佳。

图2 不同干预条件下小鼠移植瘤的体积Fig.2 Tumor volume of mice under different intervention

2.3 塞来昔布和跑台运动对人结肠癌小鼠TGF-β1、VEGF及CD105标记的MVD的影响

塞来昔布和跑台运动干预35 d后，Ca与Ce组CRC移植瘤小鼠血清TGF-β1水平无统计学差异，TE组、TE+Ce组则显著低于其他2组（图3A），提示单一运动干预和塞来昔布联合运动干预均可降低CRC小鼠血清TGF-β1水平，且塞来昔布联合运动干预的抑制效果显著优于单一塞来昔布或跑台运动干预。

TE组、Ce组、TE+Ce组小鼠血清VEGF水平均显著低于Ca组，3组间比较也存在显著差异（图3B），提示单一塞来昔布、单一运动干预、塞来昔布联合运动干预均可明显降低人CRC小鼠血清VEGF水平，且塞来昔布联合运动干预的效果明显优于单一塞来昔布或运动干预，单一塞来昔布与单一运动干预效果相当。

图3 不同干预条件下小鼠TGF-β1、VEGF的表达及CD105标记的MVDFig.3 TGF-β1，VEGF expression and CD105-labeled MVD of mice under different intervention

CD105标记的MVD计数结果显示，Ce组、TE组与TE+Ce组均显著低于Ca组，TE+Ce组显著低于Ce组和TE组，而后2组间无统计学差异（图3C）。提示单一塞来昔布、单一运动干预、塞来昔布联合运动干预均可显著降低人CRC小鼠移植瘤组织CD105标记的MVD计数，塞来昔布联合运动干预的效果明显优于单一的塞来昔布或运动干预，且单一塞来昔布与单一运动干预效果相当。

2.4 人结肠癌小鼠血清TGF-β1、VEGF水平与CD105标记的MVD计数的相互关系

人结肠癌细胞株HT-29种植50 d后，对Ca组小鼠血清TGF-β1、VEGF水平和CD105标记的MVD计数进行相关性分析，结果显示，TGF-β1水平与VEGF水平及CD105标记的MVD计数均呈中度正相关（r=0.688 5，P=0.013 3；r=0.629 1，P=0.028 2），VEGF水平与CD105标记的MVD计数呈高度正相关（r=0.915 0，P＜ 0.001）。

3 讨论

血管生成是癌细胞生长发展的典型特征，是判断肿瘤预后的重要标志之一［14］。TGF-β1、VEGF、CD105是血管生长的重要标记因子［15］。TGF-β1是一种具有调控血管形成与肿瘤细胞增殖分化的多肽链，它在肿瘤组织中高表达提示肿瘤更具侵袭性且预后不良［16］。VEGF是一种血管内皮细胞刺激因子，可促进血管内皮细胞的增殖、分裂以及血管生成，为肿瘤细胞的生长提供必需的营养和氧气［17］。VEGF在直肠癌中高表达，与肿瘤生长侵袭和转移密切相关，是评价CRC预后的参考指标之一［10］。CD105是TGF-β1受体复合物之一，主要存在于血清中，在新生的内皮细胞中高表达，是检测内皮细胞增殖和肿瘤新生血管的特异性标志物［10］；MVD是衡量和评价肿瘤血管生成的可靠指标，与肿瘤浸润转移有关。CD105标记的MVD与CRC的发展、转移密切相关，是判断预后的重要指标［10，18-19］。研究［19-20］表明，TGF-β1能够诱导VEGF表达，VEGF表达与CD105标记的MVD呈显著正相关。SAITO等［8］发现胃癌组织中TGF-β1可上调VEGF表达，刺激肿瘤血管形成，使肿瘤组织MVD增多，促使肿瘤侵袭转移。本研究结果显示，人结肠癌小鼠血清TGF-β1、VEGF水平和CD105标记的MVD计数呈正相关，提示三者共同参与了结肠肿瘤新生血管形成，共同调节肿瘤的生长发展。

非甾体抗炎药昔布类选择性COX-2抑制剂在CRC的防治中发挥着重要作用。研究［3］表明，塞来昔布可抑制结直肠肿瘤细胞增殖分化，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成，其机制尚未完全明确，可能与塞来昔布激活了调控细胞周期的因子、提高内质网应激、抑制COX-2通路等有关［4-5］。越来越多的证据表明，运动不但可以降低不同类型恶性肿瘤的发病风险，还能抑制肿瘤的增殖和转移，延长生存时间［21］。运动可以参与癌症治疗的全过程，被证实是一种安全有效的干预方式，具有很好的耐受性［22］。研究［13，23］发现，塞来昔布和运动可能直接作用于某些血管标志物，抑制肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长和转移。本研究发现，塞来昔布联合运动干预可显著提高人结肠癌小鼠生存率，抑制移植瘤体积增长，降低血清TGF-β1、VEGF水平及移植瘤组织CD105标记的MVD计数，且效果显著优于单一塞来昔布或运动干预。提示塞来昔布和运动干预能抑制肿瘤的生长和发展，提高生存率，二者均可通过抑制TGF-β1、VEGF、CD105标记的MVD水平，抑制新生血管的形成，并可能存在协同效应。

研究［19］表明，VEGF和CD105标记的MVD是预测患者预后的可靠指标，VEGF、CD105高表达的CRC患者预后较差。本研究发现，TGF-β1表达水平也同样与CRC小鼠生存率有关，它可能是预测患者预后的另一指标，联合检测TGF-β1、VEGF、CD105标记的MVD水平是否会提高判断CRC预后的可靠性和精确性，有待进一步研究。研究［24］发现，塞来昔布在诱导CRC细胞凋亡时，可通过激活内质网应激（与COX-2无关的途径）提高VEGF水平，从而削弱塞来昔布对肿瘤的抑制作用，容易带来耐药性。本研究中，塞来昔布联合运动干预对VEGF的抑制作用优于单一的塞来昔布治疗，其原因可能与运动抑制了内质网应激这一负面效应有关。

综上所述，塞来昔布联合运动干预可有效抑制人结肠癌小鼠移植瘤的生长，提高小鼠生存率，其效果优于单一的塞来昔布或运动干预，是一种有效的CRC防治手段。二者可能是通过抑制TGF-β1、VEGF表达及CD105标记的MVD，从而抑制肿瘤血管形成，而且可能在抗肿瘤血管生成、抑制CRC发展中存在协同作用。