基因重组发光菌应用于环境样品毒性的测试

方贵桢， 胡立新， 黄国勇， 赵建亮， 应光国

(华南师范大学环境学院∥广东省化学品污染与环境安全重点实验室∥环境理论化学教育部重点实验室，广州 510006)

由于生活和生产的需求，中国的化学品生产量和使用量数目庞大，且仍保持日趋增多的趋势. 但相应的化学品行业管理制度和风险防控措施不到位，许多化学品未经有效处理就直接排放到环境中. 科学研究表明:工业生产中产生废气、废水、废渣未经处理后排放会导致土壤中的重金属含量增加[1]；种植业化学品通过化学肥料、化学农药和农膜的使用释放到环境中[2]，导致环境中化学品污染及健康风险问题日渐突出. 现阶段，化学分析可以获得环境样品的种类和含量等信息，但不能准确反映样品的毒性以及评估这些化学品暴露引发的环境风险[3]，为此，本文采用生物毒性测试来表征环境样品的生物毒性及其生态风险.

传统的生物毒性试验可以用的试验生物包括藻类[4]、原生动物类[5]、鱼类[6]、植物[7]和其他生物体，但这些受试生物大多需要特殊设备和专业操作人员、试验周期长、重复率低，试验生物标准化也备受争议[8-9]. 而细菌，具有生物机体小、种群数量大、生长繁殖快、结构简单、对环境变化敏感等优点，与传统的生物毒性试验相比，细菌毒性试验可以在短时间内对受试物的毒性进行评价，预测受试物的环境毒性，可操作性强. 发光细菌是一类可以自身发出蓝绿色荧光的细菌，发光强度持续、稳定，一旦遭遇到外界不利因素，如遇到有毒的物质时，其发光强度会受到抑制，抑制的程度跟暴露环境中毒物的质量浓度(毒性)大小有关.

为了验证基因重组发光菌在生物毒性测试中的可靠性，本研究采用微板测试法(MTA)，分别利用基因重组发光菌和费氏弧菌对8种重金属化合物(ZnSO4、CuSO4、FeCl3、HgCl2、MnCl2、CdCl2、CoCl2和K2Cr2O7)进行生物毒性测试. 利用非线性拟合工具GraphPad Prism 4中Sigmoid函数和Matlab 的LS-SVM函数研究其剂量-效应关系，计算其半数致死效应质量浓度，从而评价重金属对基因重组发光菌和费氏弧菌的生物毒性. 进一步以基因重组发光菌为受试生物，比较了“绿色溶剂”(离子液体)和有机溶剂的毒性效应，论证基因重组发光菌在生物毒性测试中的可行性.

1 研究方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器与试剂 仪器：高速冷冻台式离心机(Beckman， CA92821，美国)；多功能酶标仪(BioTek，美国)、 震荡培养箱(上海知楚，中国)；白色96微孔板(COSTAR，美国)；生物安全柜(上海博讯，中国)；高压蒸汽灭菌器(Panasonic，日本)；不同量程的单、多通道移液器(Eppendorf，德国). 试剂：硫酸卡那霉素(Amresco，美国)；CuSO4(Sigma-Aldrich，美国)；ZnSO4·7H2O(AR，上海麦克林)；HgCl2(AR，贵州铜仁利祥)；FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、CdCl2·2.5H2O、CoCl2·6H2O、K2Cr2O7均购买于天津市大茂化学试剂厂. 甲醇(HPLC级，德国)、无水乙醇、乙腈(HPLC级，美国)、二甲基亚砜(DMSO，HPLC级，上海麦克林)、丙酮(HPLC级，美国). 6种不同烷基链长度的离子液体(ILs)购买于中科院兰州化学物理研究所.

1.1.2 测试菌株 采用的测试菌株是插入了luxCDABE基因的基因重组发光菌E.coliHB101 pUCD607[10](以下简称基因重组发光菌).Lux基因是海洋细菌费氏弧菌(Vibriofischeri)中与细菌生物发光相关的基因，将携带有该基因的pUCD607质粒导入非发光细菌中，可使其稳定表达lux基因. 只要代谢正常，菌株就可以持续产生生物发光. 当菌株接触到能够影响其代谢活性的有毒物质时，生物发光就会减弱. 生物发光受抑制的程度可以用适当的光电传感器检测，从而推算毒物的毒性大小. 费氏弧菌来源于杭州绿洁水务科技股份有限公司，是海洋中一种革兰氏阴性菌，由于细菌之间相互交流，启动相关基因的表达而引起生物发光. 任何影响细胞代谢的作用都会导致其发光的减少，所以费氏弧菌被普遍作为环境测试指标[11].

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准溶液的质量浓度以重金属离子来计算. 以ZnSO4·7H2O(Zn2+)为例，称取439.83 mg的ZnSO4·7H2O加蒸馏水溶解，最后定容到100 mL，得到Zn2+储备液的质量浓度为1 g/L. 其他重金属离子按照同样的方法配制成1 g/L储备液. 离子液体1-乙基-3-甲基咪唑氯盐(IM-2)、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(IM-4)、1-己基-3-甲基咪唑氯盐(IM-6)的储备液的质量浓度为200 g/L，1-辛基-3-甲基咪唑氯盐(IM-8)的储备液的质量浓度为100 g/L，1-癸基-3-甲基咪唑氯盐(IM-10)、1-十二基-3-甲基咪唑氯盐(IM-12)的储备液的质量浓度为50 g/L,有机溶剂直接用纯的试剂作为储备液. 所有的储备液均避光室温保存.

1.2.2 基因重组发光菌试验 含有30 μg/L硫酸卡那霉素的液体培养基的配制：称取10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉、1 g葡萄糖溶于1 000 mL蒸馏水中，调节pH到7. 然后121 ℃高压蒸汽灭菌20 min. 待培养基的温度降到55 ℃时，加入100 μL 0.3 g/L的硫酸卡那霉素，摇匀备用.

基因重组发光菌的培养：从冰箱中取一瓶基因重组发光菌的冻干粉，加入0.5 mL 0.1 mol/L 的KCl溶液，放到摇床中(20 ℃、150 r/min)培养20 min，进行菌种的复苏. 然后取200 μL菌液接种到50 mL之前准备好的培养基中，20 ℃、150 r/min条件下培养24 h. 然后取100 μL培养了24 h的菌液接种到50 mL新的液体培养基中，20 ℃、150 r/min条件下培养24 h.

以白色96微孔板为载体，基因重组发光菌E.coliHB101 pUCD 607为试验生物，以相对发光单位为检测信号，采用微板毒性分析法进行EC50的测定. 将96孔微板的第1列的6个孔加蒸馏水作为空白对照，第2～12列设计为化合物的11个质量浓度梯度. A～F行为6个平行，每孔加入150 μL的样品，用多通道移液器往每一列加入50 μL重新悬浮的基因重组发光菌. 由于试验暴露的时间较短，基因重组发光菌受时间影响较大，酶标仪扫描整块微板中加有样品的72孔时间为36 s，为了减少误差，加入菌液的时间控制约36 s. 加入菌液开始计时，放到酶标仪中轨道震荡15 s，计时器到14 min 45 s，点击酶标仪的开始按钮(酶标仪有15 s的缓冲时间)，测定每一个微孔的相对发光单位. 舍弃发光值的最高值和最低值，计算出 4个空白发光值的平均值(I0)和样品每个质量浓度的平均值(I)，按公式(1)计算出不同物质在不同质量浓度下对基因重组发光菌的抑制率(E)[12]:

E=(I0-I)/I0×100%.

(1)

1.2.3 费氏弧菌试验 费氏弧菌培养基的配制：称取5 g蛋白胨、0.5 g酵母粉、3 mL甘油、30 g NaCl、6.10 g NaH2PO4·H2O、2.75 g KH2PO4·3H2O、0.204 g MgSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2HPO4溶于1 000 mL蒸馏水中，调节pH到7，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

费氏弧菌的培养：取一瓶费氏弧菌冻干粉加入2 mL培养液室温复苏5 min，将其全部接种到50 mL费氏弧菌培养基中，20 ℃、180 r/min条件下培养36 h. 然后取200 μL菌液接种到新的培养基中，20 ℃、180 r/min条件下培养36 h，放到4 ℃冰箱备用. 在测试过程中，如果费氏弧菌的发光值超过酶标仪的量程，用2%的NaCl进行稀释.

将96微孔板的第1列的6个孔作为空白对照(直接用蒸馏水)，第2～12列设计为化合物的11个质量浓度梯度. A～F行为6个平行，每孔加入150 μL的样品，用多通道移液器从第1～12列的每一列加入20 μL 20%的NaCl调节渗透压，然后加入30 μL费氏弧菌菌液. 后续的步骤与基因重组发光菌保持一致.

1.3 数据处理

试验数据差异性分析在GraphPad Prism 4上进行，剂量-效应曲线拟合中Sigmoid函数在GraphPad Prism 4上运行，LS-SVM函数在Matlab上运行.

2 结果与讨论

2.1 毒性测试参照物验证

现行发光菌毒性测试标准方法(GB/T 15441-1995)[13]是以汞离子为毒性参照，然而汞离子为高毒物质，对环境和试验操作人员有害. 近年来，研究人员经多次筛选，发现锌离子易溶、稳定且对人和环境危害较小，作为阳性对照具有安全、稳定等优势，因此建议选用锌离子作为发光菌毒性测试阳性对照物质[14].

为此，本试验选取了上述2种离子作为阳性对照物质，对比了其试验效果. 从表1可知，锌离子对基因重组发光菌的抑制敏感性(EC50)比汞离子大. 从图1可以看出锌离子的重现性更好，通过分析发现：锌离子EC50的变异系数较小(16.79%)，说明锌离子作为阳性对照物质具有较好的稳定性.

图1 阳性对照物质锌离子对基因重组发光菌的毒性效应

Figure 1 The toxic effects of positive control substance zinc ions on gen recombinant luminescent bacteria

2.2 基因重组发光菌毒性测试的灵敏度比较

为检测基因重组发光菌毒性测试方法的灵敏度，本试验选用环境中常见的8种重金属(ZnSO4、CuSO4、FeCl3、HgCl2、MnCl2、CdCl2、CoCl2和K2Cr2O7)为目标化合物，对其测试灵敏度进行比较.

以8种重金属离子为目标化合物，以费氏弧菌为受试生物进行毒性测试，用Boltzmann Sigmoidal函数对化合物质量浓度与费氏弧菌发光抑制率进行拟合，得到上述重金属离子对应的EC50，如表1所示分别为1.978、17.860、5.214、0.150、47.370、18.290、2.898和11.980 mg/L. 以8种重金属离子为目标化合物，以基因重组发光菌为受试生物进行毒性测试，用Boltzmann Sigmoidal函数对化合物质量浓度与基因重组发光菌发光抑制率进行拟合，得到上述重金属离子所对应的EC50分别为1.203、1.646、1.226、0.659、9.935、8.718、1.045和10.550 mg/L.

表1 8种重金属对费氏弧菌和基因重组发光菌的剂量-效应曲线拟合信息

注：a、b和c分别表示Boltzmann Sigmoidal的拟合参数，EC50表示半数效应质量浓度，R2表示相关系数的平方.

通过比较重金属对费氏弧菌和基因重组发光菌的毒性作用，结果表明：以基因重组发光菌为受试生物的毒性测试结果(EC50)比费氏弧菌灵敏度更高. 如图2所示，在铜离子、锰离子、铁离子和镉离子的毒性作用方面，基因重组发光菌和费氏弧菌EC50之间存在显著性差异(P<0.05)，表明基因重组发光菌在毒性测试方面具有较高的灵敏度. 不同重金属对同种细菌的毒性差异以及同种重金属对不同细菌的毒性差异主要取决于以下3点: (1)受试生物的敏感性；(2)不同重金属的生物可利用性；(3)重金属离子毒性的表达能力，即与水中其它阴离子络合能力[15].

图2 8种重金属对基因重组发光菌和费氏弧菌的毒性比较

Figure 2 The comparison of the toxicity of eight heavy metals to gene recombinant luminescent bacteria andVibriofischeri

2.3 应用重组发光菌对有机溶剂和“绿色溶剂”进行毒性测试

离子液体是指在室温或者室温附近温度下呈液体状态的物质，主要由阴离子和阳离子2部分构成，具有蒸汽压较低、热稳定性和化学稳定性较高、导电性较高、热容量较大等特点[16]，与一般的有机溶剂相比，离子液体不具有挥发性，对大气环境的影响很小. 基于这些特点，绿色化学的研究者认为：离子液体可作为挥发性有机溶剂的替代物. 然而，近年来有研究表明：离子液体的大规模使用也会对水环境造成很大的危害[17]. 鉴于此，本试验比较了6种常用的有机溶剂和6种不同烷基链长度的离子液体对重组发光菌的毒性效应.

结果表明：6种有机溶剂对基因重组发光菌的毒性效应中，只有甲醛对基因重组发光菌的剂量-效应曲线是经典的S-型曲线(图3)，其他5种有机溶剂均存在hormesis效应，与之前学者的研究结果一致[18-20]. 从毒性数据可以看出，相比之下二甲基亚砜的EC50最大(表2)，说明其对发光细菌的毒性最小. 甲醛对发光细菌的毒性效应最大，EC50达到5.122 g/L(表2). 从甲醇对基因重组发光菌的毒性效应可以看出，甲醇对基因重组发光菌的EC50为36.120 g/L，随着暴露质量浓度的降低，发光抑制率逐渐减小. 当甲醇的暴露质量浓度达到10.110 g/L时，随着处理质量浓度的降低，甲醇对基因重组发光菌产生刺激作用，在处理质量浓度达到2.319 g/L时，刺激效应最强(-65.36%). 乙醇、丙酮、二甲基亚砜和乙腈对发光菌的剂量-效应曲线与甲醇类似，在较低剂量下均存在刺激效应. 其零点效应质量浓度分别为54.050、26.050、122.500、38.700 g/L，最大刺激效应浓度为9.246、4.687、12.890、11.510 g/L(表2). 据报道，有机溶剂乙腈、甲醇、乙醇和丙酮对发光细菌-青海弧菌Q67的EC50值分别为36.530、71.730、79.630、46.580 g/L[18]，本研究的基因重组发光菌对于以上4种有机溶剂的EC50分别为47.880、36.120、52.140、10.270 g/L，相对于甲醇、乙醇、丙酮，基因重组发光菌比青海弧菌Q67灵敏性高，而相对于乙腈，青海弧菌Q67灵敏性更高，可能是由2种菌自身的内部条件所决定的，有待更进一步的研究.

关于有机溶剂在低剂量下对基因重组发光菌产生刺激作用，研究人员主要存在2种观点：一种是有机溶剂在低剂量下诱导细胞内NADH氧化酶，使细菌分裂加速，发光强度增加；另一种是低剂量下有机溶剂引起发光细菌DNA突变而影响发光[21].

表2 6种有机溶剂对基因重组发光菌的剂量-效应曲线拟合信息

注：ZEC表示零效应点质量浓度，EC表示最大刺激效应点质量浓度，EC50表示半数效应质量浓度，R2表示相关系数的平方，表3同.

研究表明(图4)：6种不同烷基链长度的咪唑氯盐离子液体对重组发光细菌的毒性效应中，IM-2在处理质量浓度低于22.010 g/L时存在刺激效应，随着处理质量浓度的降低，刺激效应在4.687 g/L时达到最大. 其他5种离子液体对基因重组发光菌的剂量-效应曲线均是经典的S-型(图4). 烷基链上碳原子个数从4～12，其相对应的EC50分别为9.131、0.219、0.012、0.024和0.016 g/L(表3).

随着咪唑氯盐离子液体烷基链长度的增加，其毒性效应存在增加的趋势，表现出明显的烷基链-效应关系. 通过对烷基链上碳原子个数与其对应的EC50进行分析，可以发现烷基链-效应关系符合S-型曲线，且呈现显著的相关性(R2=1.000). 研究表明:离子液体随着烷基链长度的增加，对大肠杆菌的存活率的影响越来越大，离子液体能够损伤细胞膜，影响细胞膜的通透性，使得胞内细胞器和生物大分子外泄，从而抑制细菌的生长[22].

图4 6种不同烷基链长度离子液体对基因重组发光菌的剂量-效应曲线

表3 6种离子液体对基因重组发光菌的剂量-效应曲线拟合信息

综上所述，通过对咪唑氯盐离子液体和常见有机溶剂进行EC50比较发现:有机溶剂的EC50比离子液体的值大(P<0.05)，说明离子液体对发光菌的毒性显著高于有机溶剂(图5)，具有较强的毒性作用. 作为有机溶剂替代物的“绿色溶剂”可能存在潜在的环境风险.

图5 有机溶剂和离子液体对基因重组发光菌的毒性比较

Figure 5 The comparison of toxicity of organic solvents and ionic liquids to gene recombinant luminescent bacteria

3 结论

(1)因锌离子对环境污染较小以及稳定性较高，基因重组发光菌毒性测试以锌离子代替汞离子作为阳性对照，具有一定的可行性.

(2)通过对基因重组发光菌和费氏弧菌毒性测试灵敏度的比较发现，基因重组发光菌具有较高的灵敏度和稳定性.

(3)通过对咪唑氯盐离子液体和常见有机溶剂进行EC50比较发现，离子液体对基因重组发光菌的毒性效应显著高于常用有机溶剂.