不同外源基因拷贝数背景CHO细胞的宿主细胞蛋白种类的研究

高侨，余垚，蔡洁行

·论著·

不同外源基因拷贝数背景CHO细胞的宿主细胞蛋白种类的研究

高侨，余垚，蔡洁行

200137 上海药明生物技术有限公司/复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室（高侨）；200438 上海，复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室（余垚）；200137 上海药明生物技术有限公司（蔡洁行）

研究外源基因拷贝数、生产工艺、细胞多样性对宿主细胞蛋白表达的影响。

构建空载体 CHO K1 细胞株，检测其外源基因拷贝数，根据拷贝数的低、中、高对细胞进行分类。使用不同的生产工艺测试低拷贝、中等拷贝和高拷贝的细胞群，观察其宿主细胞蛋白表达之间的差异。最后将三个拷贝数水平的细胞群进行混合，再生产，观察其混合表达的宿主细胞蛋白与单独生产时表达宿主细胞蛋白的差异。

研究结果显示，不同拷贝数背景的细胞群之间表达宿主细胞蛋白相差 6% ~ 13%。相同的细胞进行不同的工艺生产时，也因为基础培养基和补料的不同而使宿主细胞蛋白的种类不同。细胞多样性增加并不能引起宿主细胞蛋白表达的种类增多。

宿主细胞蛋白的表达与外源基因拷贝数、生产工艺以及细胞群的多样性有关。

CHO 细胞； 宿主细胞蛋白； 外源基因拷贝数； 生产工艺； 多样性

中国仓鼠卵巢细胞（Chineseovary cell，CHO），是治疗性蛋白在工业生产中最为常用的哺乳动物细胞。它因为易于悬浮培养，具有良好的翻译后修饰以及折叠等功能，产物胞外分泌，产量高而成为工业生产中最受欢迎的哺乳动物细胞。而在治疗性蛋白生产的过程当中，一些复杂的源于宿主细胞的蛋白也随着治疗性蛋白的表达而一起被表达出来，通常称之为“宿主细胞蛋白”[1]，简称 HCPs。宿主细胞蛋白如果残留在药物制剂中，会引起人体的免疫应答反应，如：发热、水肿甚至休克等[2]。药物监管部门最关注患者用药的安全性，因此 HCPs 的监控和残留检测变得越来越重要。市面上目前已经有商业化 HCPs 检测试剂盒（Cygnus F015），但 CHO HCPs 覆盖率仅为 40% ~ 60%[3]。因此，药监局要求药企在临床 III 期使用特异性构建的空载细胞株上清制备的 ELISA 试剂盒进行 HCPs 残留量检测[4-5]。从侧面说明 HCPs 的表达量可能与宿主类型、外源载体插入等因素相关[6]。目前对于 CHO 细胞宿主细胞蛋白表达与生产工艺的关联，与外源基因插入拷贝数的关系；与细胞多样性的关系研究较少。本实验就此三方面利用野生型 CHO K1 细胞进行外源基因的转染和筛选，开展了相关研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 本研究所使用的 CHO K1 细胞和载体均为上海药明生物技术有限公司自主专利的产品。检测空载质粒拷贝数的探针及引物订购于苏州金唯智生物科技有限公司。

1.1.2 试剂和仪器 CD CHO 培养基，转染使用的 Freestyle Max 系统、BM003H 培养基、杀稻瘟菌素、博来霉素以及细胞培养使用的 CO2静置培养箱均购自赛默飞世尔科技有限公司；BM020H 培养基、FM020A 补料、FM016 补料购自 GE 生命科学公司；提取 DNA 使用的 DNeasy Blood &Tissue Kit 购买自美国 Qiagen 公司；细胞计数仪为 Beckman Coulter 公司产品；摇床为瑞士阿道夫科耐公司产品。

1.2 方法

1.2.1 表达外源基因的 CHO K1 空载体细胞株的建立 选用公司自主专利的空载体质粒及 CHO K1 宿主细胞，该细胞使用 CD CHO 培养基，在 36.5 ℃，6% CO2、225 r/min 转速下进行培养。应用 FreeStyle Max 转染系统将两个空载体质粒 Vector 1 和 Vector 2 转染至悬浮培养的 CHO K1细胞中。转染后，对细胞进行活细胞密度及细胞活率的检测，根据该结果将细胞铺板至 96 孔板中，同时更换为筛选性培养基，筛选抗生素为博来霉素和杀稻瘟菌素。随后定期更换新鲜筛选培养基进行筛选，培养约 2 周后，待孔板内细胞恢复，挑选恢复状况良好的细胞进行扩增，分别逐步扩增至 24 孔板，6 孔板，最后至摇管。筛选期间，细胞在 36.5 ℃、6% CO2下进行培养。进入摇管后，依旧使用带有筛选压力的培养基进行传代，并对细胞进行保种冻存，共传 4 代。至此，能表达外源基因的空载体 CHO K1 迷你细胞群建立完成，该细胞群未进行单克隆挑选的步骤。

1.2.2 外源基因相对拷贝数的检测 选取已知 Vector 1 和 Vector 2 绝对拷贝数的克隆细胞株作为对照。利用 qPCR 技术进行外源基因相对拷贝数的检测。使用 DNeasy Blood & Tissue Kit 对细胞的 DNA 进行抽提备用。设计针对载体序列的引物，以 B2M 管家基因为内参，进行 PCR 扩增，最后使用 ABI 7500 PCR 仪进行检测，7500 Software 软件进行数据读取和分析。引物及探针序列设计如表 1 所示。根据外源基因相对拷贝数的结果，将细胞分为低拷贝、中等拷贝和高拷贝，共 3 类。并将每一类的迷你细胞群进行混合，分别命名为 HCP mixture level 1（低拷贝）、HCP mixture level 2（中等拷贝）、HCP mixture level 3（高拷贝）三个细胞群。

1.2.3 不同生产工艺针对不同拷贝数背景的细胞群进行宿主细胞蛋白的生产 选用两个不同的批次补料工艺 A 和 B，工艺 A 与工艺 B 的参数设置如表 2。对 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 进行批次补料实验，批次补料期间，在补料当天，利用 Vi-CELL XR 监测期间活细胞密度和细胞活率的数值变化，考察基础培养基和补料对三个细胞群的生长以及 HCPs 表达的影响。

表 1 引物及探针序列

1.2.4 不同多样性细胞群进行宿主细胞蛋白的生产 将 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三个细胞群复苏传代后，再次进行等密度混合，混合为一个 HCP 总细胞群，选择表 1 中的工艺 A 进行批次补料实验。批次补料期间，在补料当天，利用 Vi-Cell XR 监测期间活细胞密度和细胞活率的数值变化，考察细胞群多样性对 HCPs 表达的影响。

1.2.5 宿主细胞蛋白种类的分析与对比 收获批次补料实验的上清，研究胞外分泌的 HCPs，2D-Gel 法进行宿主细胞蛋白种类分析。

2 结果

2.1 表达空载体 CHO K1 细胞群的筛选

本实验成功构建了表达外源基因的空载体细胞群，可正常在带有筛选压力的基础培养基中稳定传代存活。

表 2 批次补料实验生产工艺参数对比

2.2 不同拷贝数背景的细胞群建立

通过 qPCR 方法对成功构建的细胞群中的外源基因进行了相对拷贝数的检测，Vector 1 和Vector 2 相对拷贝数检测分布如图 1 所示。根据相对拷贝数的检测结果，将两个载体 Vector 1 和Vector 2 拷贝数均处于 1 ~ 10 之间的细胞群混合，命名为 HCP mixture level 1；两个载体拷贝数中，只要有一方拷贝数处于 11 ~ 20 之间，将这一类细胞群进行混合，命名为 HCP mixture level 2；两个载体拷贝数中，只要有一方大于 21，将这一类细胞群进行混合，命名为 HCP mixture level 3。

2.3 不同生产工艺的批次补料实验

选择 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三个细胞群进行批次补料实验的研究。选用工艺 A 与工艺 B 进行批次补料实验，培养 2 周。生长曲线如图 2 所示。

从批次补料实验的结果来看，不同拷贝数背景的细胞群在工艺 A 下，活率变化并没有太大的区别，而在活细胞密度的峰值上表现出不同，分布在 19E6 ~ 25E6 cells/ml 之间。不同拷贝数背景的细胞群在工艺 B 下，活率变化也没有太大的区别，活细胞密度的峰值相差不大，但在第 6 天后，HCP mixture level 1 和 HCP mixture level 2 还继续维持高密度的表现，而 HCP mixture level 3 活细胞密度则开始渐渐降低。

图 1 qPCR 技术检测细胞群外源基因相对拷贝数分布情况

Figure 1 The relative copy number distribution of exogenous genes using qPCR

Figure 2 Growth curves of pools with different copy number backgrounds in process A (A) and B (B)

A：HCP mixture level 1 在工艺 A 下 HCPs 2D-Gel 检测胶图；B：HCP mixture level 2 在工艺 A 下 HCPs 2D-Gel 检测胶图；C：HCP mixture level 3 在工艺 A 下 HCPs 2D-Gel 检测胶图；D：HCP mixture level 2 在工艺 B 下 HCPs 2D-Gel 检测胶图

A: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 1 under process A; B: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 2 under process A; C: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 3 under process A; D: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 2 under process B

图 3 2D-Gel 检测胶图

Figure 3 2D-Gel results

2 周培养结束后，收获上清，利用 2D-Gel 方法研究胞外分泌的宿主细胞蛋白，利用 PDQuest 软件进行 HCPs 种类的分析。结果如图 3。PDQuest软件分析 HCPs 种类，结果如表 3 所示。

从 HCPs 种类分析结果来看，在相同工艺 A 下，对比 HCP mixture level 1、2、3 三种拷贝数背景的 HCP 种类，HCP mixture level 2 > HCP mixture level 1 > HCP mixture level 3。以 HCP mixture level 1 为对比基准，HCP mixture level 2 较 HCP mixture level 1 种类多 84 种，占 HCPs 基准种类的 6%。HCP mixture level 2 较 HCP mixture level 3 种类多 167 种，占 HCPs 基准种类的 13%。推测不同拷贝数背景的细胞群即使是在相同的工艺下，HCPs 的种类差别也较大。

表 3 HCPs 种类分析

对比 HCP mixture level 2 在不同的工艺 A、B 中，HCPs 种类相差 92 种，占 HCPs 基准种类的7%。也可推测出，即使遗传背景相同，不同的生产工艺也会在 HCPs 的表达上引起变化。

图 4 HCPs 总细胞群在工艺 A 下生长曲线图

Figure 4 Growth curves in HCPs mixed pools in process A

2.4 细胞多样性

将 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三个细胞群进行混合，混合后成为多样性最多的一个细胞群，选用工艺 A 进行批次补料实验，培养 2 周。生长数据如图 4 所示。

从细胞生长上来看，混合后培养的活率变化与用 A 工艺单独培养 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 时无太大差别。活细胞密度变化图中可看出，活细胞密度峰值达到 20E6 cells/ml，与单独培养 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 时对比，处于中等水平。

培养 2 周结束，收获上清，利用 2D-Gel 技术研究胞外分泌的宿主细胞蛋白的表达情况。如图 5 所示。

经过 PDQuest 软件分析，HCPs 总细胞群在工艺 A 下所表达 HCPs 共 1299 种。通过对比，HCPs 总细胞群与 HCP mixture level 1 相比少2 个点；与 HCP mixture level 2 相比少 86 个点，与 HCP mixture level 3 相比多 81 个点；并未出现预期中 HCPs 总细胞群所表达的宿主细胞蛋白种类为三个细胞群所表达宿主细胞蛋白种类的总和[7]。这可能是由于细胞群经过再次混合，细胞群的多样性增加，同时细胞与细胞之间竞争变得更加激烈[8]，生长快的细胞会逐渐占据优势，生长慢的细胞被逐渐淘汰，导致宿主细胞蛋白谱变窄，进而最终影响到宿主细胞蛋白的表达[9-13]。

3 讨论

HCPs 的去除和最终产品中其含量的鉴定，在工业生产和临床申报中是十分重要的。虽然目前市面上已经有商业化的 ELISA 试剂盒检测产品中HCPs 的残留，但由于其检测HCPs 覆盖率低，不能满足临床申报时 CFDA 的要求[14-15]。

图 5 HCPs总细胞群在工艺 A 下HCPs 2D-Gel 检测胶图

Figure 5 HCPs 2D-Gel results of HCPs mixed pools

由于蛋白的表达可能受到外源基因插入的拷贝数、生产时所用的基础培养基、补料、生产所用的宿主细胞类型，以及生产所用细胞的多样性等多方面因素影响。本实验针对以上影响因素，设计了一系列实验，成功构建了 CHO K1 空载体宿主细胞，获得了不同拷贝数背景的细胞群。通过对比，发现低拷贝、中等拷贝、高拷贝的细胞群在相同工艺进行生产的情况下，宿主细胞蛋白的种类差异高达 6% ~ 13%，说明外源基因的拷贝数对宿主细胞蛋白的表达的确存在影响。选取中等拷贝数背景的 HCP mixture level 2 进行不同生产工艺的 HCPs 对比，发现即使是同一株细胞，在不同的生产工艺下，HCPs 种类相差约 7%。分析原因，可能是由于基础培养基或补料的成分中如某些氨基酸，维生素等的配比有所差别，而由于细胞群中某些细胞对某些氨基酸的消耗量要求更高，这种氨基酸的浓度缺失导致这类细胞生长及表达受到限制，细胞群中各类细胞的比例发生变化，进而影响了整体 HCPs 的种类变化[16-18]。进一步说明 HCPs 的表达实际上与生产工艺中的基础培养基、补料等相关。

在对三个细胞群 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 进行混合后，考察 HCPs 总细胞群的宿主细胞蛋白表达情况，发现其 HCPs 表达种类有所减少，说明 HCPs 的种类并不如预期中越增加细胞群多样性宿主细胞蛋白种类越多的设想[19-20]。由此对比市面上商业化试剂盒，该试剂盒为一个通用检测试剂盒，试剂盒中所包含的抗 HCPs 抗体，有一些免疫原性比较弱或完全不具有免疫原性，造成其并不能很好地覆盖产品中的 HCPs 种类，导致其特异性并不是很强，本实验中特异性构建的空载细胞群所生产的HCPs 相对于使用同宿主 CHO K1 构建的单克隆细胞株而言，HCPs 的表达更有针对性。本实验所构建得到的不同拷贝数背景的空载体细胞群，可根据最终产品的最终生产工艺进行选择对应的工艺生产，得到的 HCPs 种类可能会更加接近同种 CHO K1 细胞进行产品生产时所产生的 HCPs。

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Research of the host cell protein species with different exogenous gene backgrounds in CHO cells

GAO Qiao, YU Yao, CAI Jie-xing

WuXi Biologics/State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University (GAO Qiao); State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China

This research was designed to explore the effect of exogenous gene copy number, process of production and cell diversity on host cell protein expression in CHO K1 cell pools.

We successfully developed three null cell lines of CHO K1 to detect the exogenous gene copy number levels, and classify the cells according to high, medium, low levels of gene copy number. Two processes were selected to evaluate three pools for the differential expression of HCPs. Finally, all three pools were mixed together and then the differential expression of HCPs between the mixed pools with unmixed ones were evaluated by process A.

There were around 6% to 13% difference in HCPs expression among the pools with different exogenous gene copy number backgrounds. When we used the same cell line with different processes, the host cell proteins also showed differences from each other since the basic media and feed media were not the same. The addition of pool diversity didn’t lead to the increase of host cell protein species.

The host cell protein expression is influenced by exogenous gene copy number levels, process of the production and diversity of cells.

CHO cells; Host cell proteins; Exogenous gene copy number; Production process; Diversity of pools

CAI Jie-xing, Email: cai_jiexing@wuxiapptec.com

蔡洁行，Email：cai_jiexing@wuxiapptec.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.014

(YU Yao); WuXi Biologics (CAI Jie-xing), Shanghai 200137, China

2019-11-18