浙南地区乐清市非综合征型耳聋患者的致聋基因突变研究

万茹 白文静 项延包 徐晨阳 李焕铮 徐雪琴 唐少华

耳聋是我国最为常见的出生缺陷遗传疾病之一，亦是十分常见的一类导致语言交流障碍的感觉器官病变性疾病，其在新生儿群体中的发病率约为1‰～3‰[1-3]。非综合征型耳聋患者占总耳聋群体的70%，且是以听力损伤作为其唯一的临床表型。我国非综合征型耳聋患者群体中检出率最高的致聋基因为GJB2、SLC26A4、GJB3以及线粒体12SrRNA基因，总检出率可达30%～50%，故上述基因常作为检测热点基因来诊断耳聋患者[4-5]。由于该病具有明显的群体遗传异质性，即不同遗传背景或区域群体的耳聋患者可存在不同的致病基因及热点突变，因而需通过检测不同区域的耳聋患者来探索本地区的遗传突变图谱。本研究以浙南地区乐清市非综合征型耳聋患者为研究对象，联合运用耳聋基因芯片、Sanger测序及多重连接酶反应检测技术（improved multiple ligase detection reaction，iMLDR）探索浙南地区耳聋患者致聋基因突变图谱，为本地区耳聋家系的遗传咨询及产前诊断提供理论基础。

1 对象和方法

1.1 对象 遵循知情同意原则，收集就诊于温州市中心医院遗传咨询门诊的319例乐清籍（患者分布于乐清市各乡镇）耳聋患者的临床及听力学资料，年龄1～53岁。所有患者均诊断为非综合征型感音神经性耳聋，且听力损伤程度为轻度至极重度不等。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 采用德国QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit或长沙三济公司外周血DNA抽提试剂盒，严格按照试剂盒操作说明书抽提患者外周血DNA，并各取2μl DNA样本用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

1.2.2 耳聋芯片检测 采用北京博奥生物公司提供的九项遗传性耳聋基因检测试剂盒对319例耳聋患者的4个基因9种突变进行检测，包括GJB2基因c.235delC、c.299-300delAT、c.35delG 和 c.176del16位点，SLC26A4基因c.2168A＞G和c.919-2A＞G位点，GJB3基因c.538C＞T位点，线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G和m.1494C＞T位点。

1.2.3 GJB2基因Sanger测序 对基因芯片检出的23例GJB2基因单杂合突变患者行GJB2基因全编码区（外显子2）及其上游内含子100bp序列测定分析[6]，寻找可能存在的其他复合杂合突变位点。

1.2.4 SLC26A4基因检测 对基因芯片检出的10例SLC26A4基因杂合突变患者行iMLDR检测。该技术利用单核苷酸多态性及基于位点特异性杂交原理，可一次性检测4个基因共89种突变，包括GJB2基因上c.9G＞A、c.109G＞A、c.134G＞A等 24个位点，SLC26A4基因上c.946G＞T、c.1692dupA、c.1229C＞T等59个位点，线粒体 DNA上的 m.1494C＞T、m.1555A＞G、m.1095T＞C等3个位点，以及GJB3基因上的c.538C＞T、c.547G＞A、c.580G＞A等 3个位点[7]。对该方法检出的突变位点需经过Sanger测序验证来明确突变。

2 结果

2.1 耳聋芯片检测结果 319例耳聋患者中，共检出基因突变患者128例（40.13%）。检出GJB2基因突变57例（17.87%），包括双等位基因突变34例和杂合突变23例；其中c.235delC纯合突变29例、c.235delC单杂合突变20例、c.235delC/c.176del16复合杂合突变5例、c.299-300delAT单杂合突变3例。检出SLC26A4基因突变12例（3.76%），其中c.919-2A＞G纯合突变2例、c.919-2A＞G杂合突变7例、c.2168A＞G杂合突变1例、c.919-2A＞G杂合突变复合线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变2例。检出GJB3基因c.538C＞T杂合突变复合线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变1例（0.31%）。检出线粒体 12SrRNA基因突变 61例（19.12%），其中 m.1555A＞G均质型突变 60例，m.1494C＞T均质型突变1例。

2.2 GJB2基因Sanger测序结果 对基因芯片检出的23例GJB2基因单杂合突变患者进行Sanger测序，结果显示20例GJB2基因c.235delC单杂合突变患者中12例存在另一突变位点，包括复合c.109G＞A杂合突变8例、复合c.230G＞A杂合突变1例、复合c.427C＞T杂合突变1例、复合c.508_511dupAACG杂合突变2例；3例GJB2基因c.299-300delAT单杂合突变患者中检出复合c.109G＞A杂合突变2例。

2.3 SLC26A4基因iMLDR检测结果 对基因芯片检出的10例SLC26A4基因杂合突变患者行iMLDR检测，结果显示5例存在该基因上的另一等位基因或其他基因上的突变，包括复合c.1229C＞T杂合突变3例、复合c.1692dupA杂合突变1例、复合GJB2基因c.109G＞A纯合突变1例。另有3例c.919-2A＞G杂合突变、2例c.919-2A＞G杂合突变复合线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变患者中均未检出其他致病突变。

2.4 基因突变患者基因分型及其频率 综合基因芯片、Sanger测序和iMLDR检测，共检出基因突变患者128例。检出GJB2基因突变58例（18.18%），其中57例由基因芯片检出，1例由iMLDR检出。检出SLC26A4基因突变12例（3.76%），其中2例纯合突变由基因芯片检出，剩余10例杂合或复合杂合由基因芯片和iMLDR共同检出。检出线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变60例（18.81%），其中1例复合GJB3基因c.538C＞T杂合突变；检出线粒体12SrRNA基因m.1494C＞T突变1例（0.31%）。58例GJB2基因突变患者中，双等位基因突变49例，杂合突变9例。49例双等位基因突变包括c.235delC纯合突变29例，c.235delC复合c.109G＞A突变8例，c.235delC复合c.176_191del16突变5例，c.235delC复合c.230G＞A突变1例，c.235delC复合c.427G＞A突变1例，c.235delC复合c.508_511dupAACG突变2例，c.299_300 delAT复合c.109G＞A突变2例，c.109G＞A纯合突变复合SLC26A4基因c.919-2A＞G杂合突变1例；9例杂合突变包括c.235delC杂合突变8例和c.299_300delAT杂合突变1例。12例SLC26A4基因突变包括双等位基因突变6例（c.919-2A＞G纯合突变2例，c.919-2A＞G/c.1229C＞T 2例，c.919-2A＞G/c.1692dupA 1例及 c.2168A＞G/c.1229C＞T 1例），c.919-2A＞G杂合突变 3例，c.919-2A＞G杂合突变复合线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变2例，c.919-2A＞G杂合突变复合GJB2基因c.109G＞A纯合突变1例，见表1。

表1 128例基因突变患者基因分型及其频率

2.5 突变位点频率 综合上述检测，本研究对319例患者共638个等位基因进行检测，检出GJB2基因共7种类型107次突变：包括c.235delC突变83次、c.109G＞A突变 12次、c.176del16突变 5次、c.299-300delAT突变3次、c.508_511dupAACG突变 2次、c.230G＞A突变 1次、c.427C＞T突变 1次；检出SLC26A4基因共4种类型18次突变：包括c.919-2A＞G突变13次、c.1229C＞T突变3次、c.1692dupA突变1次、c.2168A＞G突变1次；检出GJB3基因c.538C＞T突变1次，见表2。线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变60次，m.1494C＞T突变1次。

表2 耳聋患者基因突变及其频率

3 讨论

本研究319例浙南地区乐清籍非综合征型耳聋患者中共检测出128例（40.13%）存在热点致聋基因突变，其中线粒体12SrRNA基因突变检出率为19.12%，该检出率高于我国多地区文献报道的0.26%～11.68%的耳聋群体携带率[8-10]，表明线粒体12SrRNA基因突变是本地区耳聋患者的最主要致聋原因。GJB2基因突变检出率为18.18%，是本地区耳聋患者中检出最高的核基因突变，该数据略低于Dai等[11]报道的全国20.94%的GJB2基因突变检出率。SLC26A4基因突变检出率为3.76%，其中纯合或复合杂合突变仅占1.88%，低于文献报道的我国耳聋群体5.11%～13.10%的突变检出率[12-14]。另仅1例患者存在GJB3基因突变，检出率为0.31%，表明该基因并非本地区耳聋患者的主要致聋基因。

基因检测结果共检出GJB2基因7种类型107次突变，其中c.235delC突变83次，占总等位基因的14.62%，表明与我国多数耳聋群体的基因突变图谱相同，c.235delC突变亦是本地区GJB2基因最主要的突变类型；其次c.109G＞A突变12次，占1.88%，该突变检出率低于4.48%～15.05%的文献报道数据[11-12]，可能与c.109G＞A突变位点不在本次耳聋基因芯片检测范围内有关。本研究对耳聋基因芯片检出的23例GJB2基因单杂合突变患者进一步行GJB2基因全编码区测序，结果发现10例患者存在c.109G＞A突变（8例c.235delC复合c.109G＞A，2例 c.299-300delAT复合 c.109G＞A），且临床表型均为听力损失中度至重度不等，进一步表明c.109G＞A突变应为GJB2基因上的致病突变，提示应将c.109G＞A突变纳入我国耳聋患者的常规热点突变检测范围内。另检出 c.176del16、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG、c.230G＞A、c.427C＞T等共5种GJB2基因突变，结果显示上述突变的等位基因频率均低于1%，故该5种突变均非本区域耳聋患者的热点突变[6]。

本研究共检出SLC26A4基因突变4种类型18次突变，其中c.919-2A＞G突变13次，占总等位基因的2.04%，是该基因上频率最高的热点突变[15-16]。基因芯片共检出2例c.919-2A＞G纯合突变、9例c.919-2A＞G杂合突变以及1例c.2168A＞G杂合突变，通过iMLDR检测该10例杂合突变患者，发现4例存在该基因上的另一等位基因突变以及1例复合存在GJB2基因c.109G＞A纯合突变，表明iMLDR是一种有效的耳聋基因分型检测技术，可用于SLC26A4基因热点筛查杂合突变患者的另一等位基因上突变的寻找或其他致聋基因上的突变检测；另有2例c.919-2A＞G杂合突变复合线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变患者中均未检出其他致病突变，结合耳毒性药物应用史及家系遗传图谱（均数代多人发病且呈现母系遗传模式），推测线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变才是该2例患者的真正致聋原因。另有3例c.919-2A＞G杂合突变患者未检出存在其他突变，推测可能是存在iMLDR检测范围外的其他位点发生突变或是在该基因上游的调控区范围内发生拷贝数变异导致复合杂合致聋，当然亦有可能该个体恰巧为人群中c.919-2A＞G杂合突变携带者，故对该类SLC26A4基因杂合突变的耳聋患者其发病机制仍有待进一步研究。

线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G或m.1494C＞T突变作为药物性耳聋发生的主要致聋遗传机制之一，当发生m.1555A＞G或m.1494C＞T突变时，线粒体核糖体A位将会在空间上形成新的1494与1555位点的G-C或A-U配对，使得人体线粒体12SrRNA与E.coil 16SrRNA上相应编码区域的结构更为相近，可增强氨基糖苷类药物在12SrRNA A位的结合力，最终导致药物性耳聋的发生[17]。本地区耳聋患者线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G或m.1494C＞T突变检出率为19.12%，该线粒体DNA突变高检出率可能与本地区患者耳毒性药物滥用增强耳聋外显率有关，另外早期乐清山地较多、地理位置相对封闭，可能较早的一批耳聋移民群体或患者中存在较高比例的线粒体DNA突变，因而通过遗传漂变及奠基者效应使得后代耳聋群体中药物性耳聋患者比例较高。上述结果提示临床耳毒性药物的慎用应作为乐清地区耳聋精准防控的主要基础策略。

GJB3基因c.538C＞T突变最先被认为与迟发型高频听力损失有关，但近来亦有文献报道质疑该位点致病性[18-19]。本研究仅检出1例男性患者存在GJB3基因c.538C＞T突变，且该患者复合存在线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G突变，家系资料及临床基因检测结果发现该先证者父亲及儿子均携带有GJB3基因c.538C＞T突变（且均未携带m.1555A＞G突变），但临床表型正常，结合耳毒性药物应用史，推测m.1555A＞G突变为该患者的真正致聋原因，而GJB3基因c.538C＞T突变可能在该患者耳聋表型中为非致病因素。

我国地域辽阔，分布不同地域或具有不同遗传背景的耳聋群体可能具有不同的致聋基因突变图谱。本研究显示线粒体12SrRNA为浙南地区乐清市非综合征型耳聋患者的首要致聋因素，该基因突变图谱与我国多地区报道的以GJB2致聋基因为首要致聋因素的检出结果不同，表明该区域耳聋患者具有独特的致聋基因突变图谱。但由于本研究先针对热点突变进行检测，再进行Sanger测序或iMLDR检测寻找与已知热点突变公共存在的复合杂合位点，研究方法上存在一定的局限性，乐清市实际的耳聋基因突变率可能略高于本研究，但本研究仍可以在一定程度上为本地区耳聋精准防控的政策决定者提供遗传学理论基础，提示耳聋基因检测及慎用耳毒性致聋药物的宣传是本地区耳聋精准防控的主要内容。