桂枝汤加减对制马钱子毒性影响的实验研究

王淑静 娄玉钤

【摘 要】目的：研究制马钱子分别配伍不同剂量的白芍桂枝汤、赤芍桂枝汤、赤白芍桂枝汤后对其毒性的影响，为制马钱子与桂枝汤的配伍提供药理学实验依据，更为临床安全有效地应用制马钱子提供实验依据。方法：通过急性毒性实验，用加权概率单位法（Bliss氏法）计算出制马钱子及其与不同比例的白芍桂枝汤、赤芍桂枝汤、赤白芍桂枝汤配伍后的半数致死量（LD50），并计算出解毒率。

结果：制马钱子的LD50为258.00 mg·kg-1;制马钱子配伍白芍桂枝汤的高、低2个剂量组的LD50分别为1642.59 mg·kg-1、8218.21 mg·kg-1;制马钱子配伍赤芍桂枝汤的高、中、低3个剂量组的LD50分别为2064.06 mg·kg-1、3485.07 mg·kg-1、9335.06 mg·kg-1;制马钱子配伍赤白芍桂枝汤的高、中、低3个剂量组的LD50分别为1792.80 mg·kg-1、2972.45 mg·kg-1、8228.82 mg·kg-1。结论：制马钱子与不同剂量组的桂枝汤配伍，其减毒率不同，为临床安全有效地运用制马钱子提供了实验依据。

【关键词】 制马钱子;桂枝汤加减;配伍;毒性;小鼠;实验研究

《本草纲目》记载马钱子“味苦，寒，无毒。主治伤寒热病，咽喉痹痛，消痞块。并含之咽汁，或磨水噙咽。”对于其无毒，后世医家产生了质疑，《本草汇言》认为其“有毒”，《本草原始》载其“味苦、寒，有大毒”。2015版《中华人民共和国药典》认为马钱子味苦、微温，有大毒，归肝脾经;可通络止痛，散结消肿;临床用于跌打损伤，骨折肿痛，风湿顽痹，麻木瘫痪，痈疽疮毒，咽喉肿痛。炮制后入丸散，每服0.3～0.6 g。全国名老中医娄多峰临床善于运用制马钱子治疗风湿病，并发现配伍桂枝汤能提高临床疗效并降低不良反应[1-3]。基于大量临床用药经验，本研究选择桂枝汤加减配伍制马钱子，观察配伍前后对制马钱子毒性的影响，为临床更加安全有效地使用制马钱子提供实验依据[4-5]。

1 实验材料

1.1 实验药物

1.1.1 制马钱子粉 生产批号20120125，按照2015版《中华人民共和国药典》规定的砂烫法将马钱子粉碎10 min，过200目筛，炮制成制马钱子，用高效液相色谱仪测得士的宁含量为14.43 mg·g-1，马钱子碱含量为4.79 mg·g-1。

1.1.2 白芍桂枝汤浸膏粉末 生产批号201201GZ，药物组成：桂枝9 g、白芍9 g、甘草6 g、生姜9 g、大枣3枚（9 g）。制作方法：将药物按比例放入煎药机中，加10倍量水，煎煮1 h，浓缩后干燥粉碎即得，后过200目筛。1 g干浸膏粉相当于原生药6.0 g。

1.1.3 赤芍桂枝汤浸膏粉末 生产批号201202GZ，药物组成：桂枝9 g、赤芍9 g、甘草6 g、生姜9 g、大枣3枚（9 g）。制作方法同1.1.2。

1 g干浸膏粉相当于原生药5.9 g。

1.1.4 赤白芍桂枝汤浸膏粉末 生产批号201203GZ，药物组成：桂枝9 g、赤芍4.5 g、白芍4.5 g、甘草6 g、生姜9 g、大枣3枚（9 g）。制作方法同1.1.2。1 g干浸膏粉相当于原生药6.4 g。

以上药物饮片由河南风湿病医院统一购买于河南省药材公司，由河南中医药大学药学院刘雅敏统一制备，密闭保存使用。另外考虑样品制备损耗等因素，3个处方均按1 g干浸膏相当于原生药6 g计算。本实验制马钱子配伍桂枝汤高、中、低剂量中，马钱子粉的含量分别为13.41%、7.19%、3.72%。

1.2 实验动物 昆明种小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，购自河南省实验动物中心，生产许可证号SCXK（豫）2010-0002。统一饲养于河南省药检所动物实验中心，辐照条形饲料，单笼喂养，自由饮水，每笼5只。实验室温度（23.0±2.0）℃，湿度50%～65%。

2 数据处理

所得实验数据运用加权概率单位法（Bliss氏法），首先通过NDST软件计算各组半数致死量（LD50），其次分别按照减毒率公式计算出各自的减毒率，最后进行比较分析。

3 实验方法及结果

3.1 单纯制马钱子LD50实验 经过前期预实验，得出制马钱子Dm（最小100%死亡量）为450 mg·kg-1，Dn（最大0不死量）为200 mg·kg-1，然后在Dm和Dn范围内选择6个剂量组，组间剂量比为0.85。取雌雄各半、体质量18～22 g的昆明种小鼠60只，随机分为6组，每组10只。实验前禁食12 h以上，自由饮水，将制马钱子粉用蒸馏水按质量等比级数依次配制成6个剂量的混悬液，按每10克小鼠体质量给予0.3 mL药液量灌胃给药。

经过多次预实验及文献报道可知马钱子的中毒特点主要表现为烦躁、呼吸增强、心跳加速、四肢抽搐，直到死亡[6-8]。达到中毒剂量后小鼠一般在10 min内死亡，死亡状态为四肢及尾巴强直性僵直、抽搐。灌胃给药后30 min内存活的小鼠，基本1 h内逐渐恢复正常。因此，实验采用一次给药的方式，给药后将存活的小鼠以给药前的饲养方式饲养，连续观察7 d，每天详细记录小鼠中毒症状、死亡数及死亡状态，实验结束后，清点各组死亡数。实验结果数据见表1，运用Bliss氏法计算后得知本实验所用制马钱子LD50为258 mg·kg-1，95%可信限为236.44～277.65 mg·kg-1。

预算知制马钱子与白芍桂枝汤、赤芍桂枝汤、赤白芍桂枝汤配伍后的3个混悬液组，即13.41%马钱子的Dm为2545 mg·kg-1，Dn为1271 mg·kg-1;7.19%马钱子的Dm为5100 mg·kg-1，Dn为2781 mg·kg-1;3.72%马钱子的Dm为14 258 mg·kg-1，Dn为5730 mg·kg-1。取昆明種小鼠540只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为9组，即3种混悬液的3个剂量组（13.41%马钱子、7.19%马钱子、3.72%马钱子），每组60只。在每组的Dm和Dn范围内按各自的组间比选取6个剂量组，每个剂量组随机分10只小鼠。在禁食不禁水12 h后，将制马钱子粉分别与3个桂枝汤浸膏粉用蒸馏水按等比级数依次配制成混悬液，灌胃量为每10克小鼠体质量给药0.3 mL。仍然采用一次给药后连续观察7 d的实验方法，实验结束后，清点各组死亡数。运用Bliss氏法计算出各组LD50及95%可信限范围，然后计算出减毒率，减毒率（%）=（混合物LD50-马钱子LD50）/马钱子LD50。（注：公式的混合物中马钱子与纯马钱子换算为同一比例）。结果见表2、表3、表4。

4 讨 论

马钱子具有较强的抗炎镇痛效果，临床上用于治疗风湿顽痹效果显著。然其药性猛烈，走窜力强，大大限制了临床使用范围。桂枝汤是《伤寒论》群方之首，功能解肌发表，调和营卫。在临床上使用桂枝汤配伍马钱子抗炎镇痛效果显著，因此桂枝汤配伍马钱子对马钱子应用于临床具有很大的指导意义。桂枝汤中选择白芍或赤芍，学者各有见地[9-11]。赤芍、白芍始分于梁代，多数医家认为，“白补而赤泻，白收而赤散”[12]。白芍味甘，酸，微寒，归肝、脾、心经，功效补血，平肝阳，缓急止血，止汗。赤芍味多甘，寒，归心、肝经，功效清热凉血，解毒，透疹。李晓丽等[13]研究表明，马钱子赤芍配伍组与马钱子单煎组比较，马钱子碱和士的宁含量均明显降低。胡锡琴等[14]研究表明，配伍赤芍的药量越大，越可以减轻马钱子的毒性，并能增强其镇痛作用，为赤芍与马钱子配伍提供很好的实验依据。吴鹏等[15]发现，赤芍中赤芍总苷能显著增加小鼠耳廓毛细血管开放量、细动脉和細静脉血管口径，其中7.5 mg·kg-1、25 mg·kg-1作用比较明显。

通过本实验可知，制马钱子配伍3种桂枝汤后，制马钱子所占混悬液13.41%、7.19%、3.72%的3个比例中，以3.72%时3种桂枝汤均对其有明显的减毒作用;纵向分析，不同的桂枝汤配伍制马钱子后，赤芍桂枝汤减毒效果最佳。桂枝汤配伍马钱子经实验证明既能减轻制马钱子毒性，又能增加其药效作用，因此值得进一步研究。本实验仅从减毒效果观察桂枝汤配伍马钱子后的减毒率，关于更深一步的作用机制，还需对桂枝汤与制马钱子配伍的毒效动力学及分子细胞影响进行更深层次的研究。

参考文献

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[4] 王淑静，娄玉钤.配伍对马钱子的减毒增效研究概述[J].风湿病与关节炎，2014，3（2）：78-80.

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[7] 苗根旺，娄玉钤，李朝阳，等.配伍生地黄、熟地黄对制马钱子抗炎、镇痛影响的实验研究[J].风湿病与关节炎，2013，2（3）：21-24.

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[11] 王巧.芍药质量控制方法与白芍总苷药物动力学研究[D].沈阳：沈阳药科大学，2005.

[12] 裴艳霞.略谈赤芍白芍的异同点[J].光明中医，2011，26（9）：1934.

[13] 李晓丽，宋振华，秦林.马钱子配伍赤芍前后毒性及镇痛抗炎作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志，1998，18（S1）：286-289.

[14] 胡锡琴，乔雷，林飞，等.配伍赤芍对马钱子LD50和镇痛作用的影响[J].陕西中医学院学报，2009，32（2）：57-58.

[15] 吴鹏，魏盼，李恋曲，等.桂枝汤通过抑制淋巴细胞向Th2细胞分化抑制变应性接触性皮炎[J].中国药理学通报，2019，35（10）：1461-1466.

收稿日期：2020-08-20;修回日期：2020-09-25