金银花标准汤剂质量标准研究

刘 涛，曾 立，谢 晓，高天赐，邓 研，万金霞

(1.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106;2.成都大学 药学院，四川 成都 610106)

0 引 言

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1]，夏初花开放前采收并干燥，有清热解毒与疏散风热的功效，表现出抗炎、抗菌及抗病毒等多种药理学活性.据不完全统计，有500种以上的中药制剂含有金银花[2].现代药理研究表明，绿原酸是金银花的主要化学成分，也是金银花主要有效成分之一，具有较强的药理活性.

中药标准汤剂是在中医药理论指导下依据临床汤剂煎煮方式规范化进行煎煮、固液分离、浓缩并干燥制得的，为衡量中药配方颗粒与临床汤剂是否基本一致的标准参照物.本研究选用15批金银花饮片制成标准汤剂，以绿原酸含量为指标，对金银花标准汤剂的质量标准进行探讨.

1 材 料

1.1 仪 器

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Ichrom5100高效液相色谱仪，大连依利特分析有限公司；TJ270-30A型傅里叶变换红外光谱仪，天津拓普仪器有限公司；DZTW电子调温电热套，北京市永光明医疗仪器有限公司；FA2004分析电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；HS-3120超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司.

1.2 试 药

15批金银花将其进行编号(JYH1～JYH15)，经成都大学药学院刘涛研究员鉴定，检查项均符合文献[1]中规定；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为怡宝水.

2 方法与结果

2.1 方 法

据文献[3]中相关要求，制定工艺流程，称取金银花饮片100 g，加12倍水，浸泡30 min，回流提取30 min，趁热滤过，药渣加10倍水回流提取20 min，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至密度1.1左右，冷冻干燥至粉末状，即得.

2.2 结 果

2.2.1 出膏率测定

金银花标准汤剂经浓缩和冷冻干燥后精密称定质量，计算实际出膏率如表1所示.

表1 金银花标准汤剂的出膏率及转移率

2.2.2 金银花标准汤剂冻干粉中绿原酸的测定

2.2.2.1 色谱条件及系统适应性试验

采用Global Chromatography C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.4%磷酸溶液-乙腈(87∶13)，检测波长为327 nm，柱温为30 ℃，体积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL，如图1所示.

2.2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取金银花标准汤剂冻干粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密移取50%甲醇50 mL后，密塞，称重，超声30 min，取出，放冷，称重，用50%甲醇补足减失的质量，滤过，精密移取5 mL续滤液于25 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得.

2.2.3 对照品溶液

取绿原酸对照品适宜，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成质量浓度为40 μg/mL的溶液，即得.

2.2.4 精密度考察

取金银花标准汤剂冻干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”项下方法制得供试品溶液，按“2.2.2.1”项下方法连续进样6 次，测得绿原酸峰面积的相对标准偏差为0.70%，可知仪器精密度良好.

2.2.5 重复性考察

取金银花标准汤剂冻干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.2.1”项下方法测定，结果显示绿原酸平均含量相对标准偏差为4.39%，可知该方法重复性良好.

2.2.6 稳定性考察

取金银花标准汤剂冻干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”项下方法制得供试品溶液后 0、2、4、8、12、24 h 时，按“2.2.2.1”项下条件测定，结果表明绿原酸峰面积的相对标准偏差为4.11%，可知供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好.

2.2.7 样品测定

取15批金银花标准汤剂及其冻干粉，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并于“2.2.2.1”项下方法进行测定，计算绿原酸的转移率，如表1所示.

3 指纹图谱分析

3.1 金银花标准汤剂冻干粉的HPLC指纹图谱分析

3.1.1 HPLC指纹图谱色谱条件

流动相为水(0.1%甲酸)A：乙腈(0.1%甲酸)B；0～8 min，B(10%～15%)；8～20 min，B(15%～20%)；20～25 min，B(20%～25%)；25～31 min，B(25%～29%)；31～36 min(29%～40%)；36～40 min，B(40%～60%);柱温为30 ℃，体积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为280 nm.

3.1.2 方法学考察

取金银花饮片标准汤剂(JYH13)，按“2.2.2.2”项下方法制得供试品，按“3.1.1”项下条件持续进样6次，可得其相对时间相对标准偏差分别为0.25%、0.24%、0.19%、1.8%、1.5%及0.19%，相对峰面积相对标准偏差分别为3.77%、4.62%、3.33%、4.27%、4.54%及4.78%，表明仪器精密度良好.取金银花饮片标准汤剂(JYH13)，按“2.2.2.2”项下方法平行制备6份供试品，按“3.1.1”项下条件测定，结果表明其平均含量相对保留时间相对标准偏差分别为0.28%、0.23%、0.24%、0.29%、0.25%及0.30%，平均含量相对峰相对标准偏差分别为3.75%、1.68%、0.88%、4.41%、2.28%及4.58%，可得该方法重复性良好.取金银花饮片标准汤剂(JYH13)，按“2.2.2.2”项下方法制得供试品后0、2、4、6、8及12 h 时，按“3.1.1”项下条件进行测定，结果表明相对保留时间相对标准偏差为1.31%、0.25%、0.12%、0.47%、0.33%及0.43%，相对峰相对标准偏差分别为0.97%、3.86%、3.25%、4.19%、2.58%及3.08%，显示供试品溶液在制备后12h内稳定性良好.

3.2 金银花标准汤剂冻干粉的紫外指纹图谱分析

3.2.1 供试品溶液制备

称取金银花标准汤剂冻干粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取纯净水50 mL，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)至溶解，冷却后，称重，用纯净水补重，摇匀，过滤，精密移取续滤液1 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用纯净水定容，摇匀，即得.

3.2.2 光谱扫描条件

以纯化水为空白对照，减少实验误差.光谱条件如下：光度模式为Abs，扫描范围为 200～400 nm，速度为快，信息采集间隔为5.0 nm.

3.2.3 方法学考察

按“3.2.1”项所述方法取金银花标准汤剂(JYH10)冻干粉制备供试品，按“3.2.2”项方式持续测定6次，得到紫外图谱在325、305、240、275、255及290 nm 处吸光度值的相对标准偏差分别为0.11%、0%、0%、0.13%、0%及0%，可知仪器精密度良好.取同一批次金银花标准汤剂(JYH10)，按照“3.2.1”项所述方法平行制备供试品 6 份，按“3.2.2”项条件测定紫外光谱图，计算所得紫外谱图在 325、305、240、275、255及290 nm 处平均含量的相对标准偏差分别为1.21%、1.13%、1.12%、1.16%、1.23%及1.06%，可得该方法重复性良好.取同一批次金银花标准汤剂(JYH10)，按“3.2.1”项所述方法制备供试品后依次在 0、1、2、3、4、及5 h 按“3.2.2”项条件测定紫外光谱图，计算所得紫外谱图在325、305、240、275、255及290 nm 处A值的相对标准偏差分别为0.66%、0.98%、2.11%、3.05%、3.72%及1.35%，可得该方法在5 h内稳定性良好.

3.2.4 金银花标准汤剂冻干粉紫外指纹图谱采集

按“3.2.1”项下方法精密称取15批金银花标准汤剂冻干粉，制备供试品，并按“3.2.2”项下条件进行测定，得其紫外指纹图谱重叠图如图2所示.

3.2.5 紫外对照指纹图谱的建立[4]

按“3.2.1”项下方法取10批(JYH1～JYH10)切合文献[1]的金银花饮片制备的金银花标准汤剂冻干粉，制备供试品，并按“3.2.2”项下条件测定其紫外指纹图谱，以各波长的A平均值作为紫外对照指纹图谱的A值.紫外对照指纹图谱如图3所示.

3.2.6 相似度计算

应用软件“IBM SPSS statistics”中双变量相关“Kendall’s tau-b”对10批金银花标准汤剂的紫外指纹图谱与紫外对照指纹图谱进行相似度分析，并进行相似度测算[5]，所得结果为0.964、0.922、0.978、0.980、0.975、0.927、0.982、0.985、0.961及0.985，表明相关性显著.

3.2.7A值

按“3.2.1”项下方法取10批(JYH1～JYH10)切合文献[1]的金银花饮片制备的金银花标准汤剂冻干粉，制备供试品，按“3.2.2”项下条件进行测定，得紫外指纹图谱，结果见表2.可见按照“3.2.1”项下方法所制备的供试品，按“3.2.2”项下条件进行测定得到紫外指纹图谱的A值应同时满足240 nm(0.581～0.744)、255 nm(0.443～0.572)、275 nm(0.252～0.390)、290 nm(0.316～0.488)、305 nm(0.350～0.513)、325 nm(0.389～0.557).

表2 10批金银花标准汤剂冻干粉紫外指纹图谱A值

3.2.8 试验验证

另取5批(JYH11～JYH15)金银花标准汤剂冻干粉，按照“3.2.1”项下方法制备的供试品，按“3.2.2”项下条件进行测定，得紫外指纹图谱，将吸光度于“IBM SPSS statistics”中双变量相关“Kendall’s tau-b”进行相似度分析，可得其紫外指纹图谱相似度和A值均满足范围要求.

3.3 金银花标准汤剂冻干粉的红外指纹图谱分析

3.3.1 供试品溶液制备

精密称取金银花标准汤剂冻干粉0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密移取50 mL纯净水，称重，超声30 min冷却后称重，纯净水补足重量.精密移取30 μL所制溶液，放于玛瑙研钵中，使用吹风机将其烘干，按1∶100和干燥KBr 粉末研磨混匀，在15 MPa真空环境中下压片1 min，得待测样品.

3.3.2 光谱扫描条件

扫描前已排除H2O和CO2的干扰，减小试验误差.按“3.3.1”项下方法制备的供试透明薄片放入傅里叶变换红外光谱仪中扫描测验，扫描范围为4 000～450 cm-1.

3.3.3 方法学考察

按“3.3.1”项下方法精密称取金银花标准汤剂样品冻干粉(JYH9)，制备供试品，按“3.3.2”项下条件连续测定6次，得红外图谱，取图谱中强吸收峰的10个对应波数作为特征峰波数，计算特征峰波数值的相对标准偏差，结果显示各特征峰波数值相对标准偏差均小于0.1%，故知该仪器精密度良好.按照“3.3.1”项下方法精密称取金银花标准汤剂样品冻干粉(JYH9)，平行制备供试品6份，按“3.3.2”项下条件测定红外光谱图，计算特征峰波数值的相对标准偏差，结果显示平均含量相对标准偏差均小于0.1%，故供试品制备方法与测定方法的重复性均良好.按“3.3.1”项下方法精密称取金银花标准汤剂样品冻干粉(JYH9)后分别在0、1、2、3、4及5 h 按“3.3.2”项下条件扫描供试品，计算特征峰波数值的相对标准偏差，结果显示各峰波数值相对标准偏差均小于0.1%，故样品在制得后5 h内稳定.

3.4 金银花标准汤剂冻干粉的物理指纹图谱分析

3.4.1 金银花标准汤剂冻干粉物理参数的确定

采用稳定性、流动性、堆积性和可压性作为金银花标准汤剂物理指纹谱的一级指标，以松密度(Da)、振实密度(Dc)、休止角(α)、干燥失重(HR)、吸湿性(H)、豪斯纳比(IH)、颗粒间空隙率(Ie)和卡尔指数(IC)作为二级指标.

1)松密度(Da)：称8.0 g(w)待测粉末缓缓加至干燥洁净的50 mL量筒中，记下待测粉末体积Va，Da=w/Va；

2)振实密度(Dc)：将上述盛有待测粉末的量筒以2s/次的频率上下振动200次，记下待测粉末的体积Vc，Dc=w/Vc；

3)休止角(α)：固定串联漏斗使其距离水平面2.2 cm，缓慢将粉末倒入漏斗中.当粉末的顶尖与漏斗的顶尖相接触时停止，测量底部圆形堆积体半径r，α=arctan(h/r)；

4)干燥失重(HR)：使用快速水分测定仪，称取约 2.0 g 的待测粉末，在105 ℃下加热10 min，记下失水率；

5)吸湿性(H)：将干燥蒸发皿放于恒温干燥器(下部放置饱和氯化钠溶液)，12 h后精密称定质量m，称取约1.0 g待测粉末平铺于上述蒸发皿中，精密称定质量m2，将蒸发皿放于上述恒温恒湿的条件下，24 h后精密称定质量m3，H=(m3-m2)/(m2-m1)；

6)豪斯纳比(IH)：IH=Dc/Da；

7)颗粒间空隙率(Ie)：Ie=(Dc-Da)/(Da×Dc)；

8)卡尔指数(IC)：IC=(Dc-Da)/Dc.

3.4.2 物理质量指标的标准化转换

便于分析，将实际测定值转换至同一尺度，即0～10.标准化转换方法及各物理质量指标的可能数值范围参考药典标准和相关文献方法[6].标准化转换方法及转换值范围如表3所示.

表3 二级物理质量指标标准化转换方法及转换值范围

3.4.3 金银花标准汤剂冻干粉物理指纹图谱的构建

按照“3.4.1”项下指标，测得10批金银花标准汤剂冻干粉的8个物理常数数值，对数值标准化，如表4所示.以10批金银花标准汤剂冻干粉的各个标准化参数值为半径绘制雷达图，并取参数值的平均值为半径绘制物理对照指纹谱雷达图，结果如图4所示.

表4 金银花标准汤剂冻干粉物理指纹谱相关指标值

3.4.4 相似度分析

采用“IBM SPSS statistics”中夹角余弦方法，对10批金银花冻干粉的物理指纹图谱与物理对照指纹图谱进行分析，相似度分别为1.000、0.929、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、0.982及0.982，表明相似度显著.

3.4.5 试验验证

取余下5批金银花标准汤剂冻干粉，按照“3.4.1”项下指标进行测定并建立物理指纹图谱，采用“IBM SPSS statistics”中夹角余弦方法与其物理对照指纹图谱进行相似度分析，符合指标要求.

4 讨 论

本研究从HPLC、紫外、红外及物理指纹图谱4个方面对金银花标准汤剂质量标准的建立进行了探讨.结果表明：紫外、红外指纹图谱相似度显著，但仍存在一定差异，有不稳定的现象，与绿原酸热敏度有关；HPLC指纹图谱的7个共有峰可反映其指纹特征[7-8]；15批金银花标准汤剂物理指纹图谱表现为相关性显著,主要是由于中药浸膏粉末的粉体学性质直接影响到制粒质量[9-10]，标准汤剂为配方颗粒的基准，所以采用其物理指纹图谱为配方颗粒的质量标准提供参考.

目前大多数对标准汤剂的研究为HPLC指纹图谱，很少从其他指纹图谱方面进行考察.本研究解决了常规配方颗粒质量标准的建立只采用HPLC指纹图谱与含量测定方法的单一化问题，增加采用了紫外、红外及物理指纹图谱方法，为配方颗粒的质量标准建立提供了更有效的支撑.

据文献[3]提出的相关出膏率及转移率指标范围对本研究相关数据进行计算，得出膏率范围为22.74%～42.22%，且每1 g含绿原酸为23.10～42.90 mg.据文献[11]给出的金银花配方颗粒出膏率范围为24.00%～33.00%，但每1g含绿原酸为23.00～55.00 mg，其转移率在给定范围内，出膏率范围却比给定范围大.为此得出，如何获得金银花配方颗粒的最佳制备工艺参数，将是下一步的研究方向.