两种培养基对新生SD大鼠神经干细胞增殖的影响*

漆国栋 漆 伟 江 琼 杨 琴 杜岵骏

1 重庆市中医骨科医院骨科 400010； 2 重庆医科大学，中医药学院，中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室

神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)是一种组织特异性干细胞，发育上来源于神经上皮，分为中枢神经干细胞与外周神经干细胞。两种细胞皆具有自我更新和定向分化为神经细胞的潜能[1-2]。作为干细胞治疗神经类疾病中最有前景的细胞类型，目前的基础与临床研究广泛集中于治疗帕金森[3-4]、脊髓损伤[5-6]、脑中风[7-8]等疾病。由于数量及损伤后局部微环境的影响，单纯靠这类细胞自身增殖修复的可能性微乎其微[9]。因此采用外源性的神经干细胞移植作用于损伤部位更具有治疗效果。本研究针对新生鼠大脑皮层来源的神经干细胞，比较两种经验培养基，建立一种更优的培养体系。

1 材料与方法

1.1 材料 Neural basal培养基(Gibco，10888022)、B-27(Gibco，A3582801)、Acctuase酶(Gibco，A1110501)、胎牛血清(Gibco，16140071)；bFGF(Peprotech，400-29)、EGF(Peprotech，400-25)；小鼠单克隆抗Nestin抗体(Millipore，MAB353)DyLight488标记山羊抗小鼠二抗(博士德，BA1126)；CCK-8(索来宝，CK04)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：依据培养过程中使用的两种不同配方的NSCs增殖培养基，设立对照组(Neural basal+2%B-27)与实验组(DMEM/F12+2%B-27+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF)。

1.2.2 原代培养：取新生24h内的SD大鼠，无菌条件下仔细剥离干净大脑皮层上的脑膜及血管，眼科镊前缘解剖分离大脑皮层组织。锋利剪刀剪成1mm3的小块。加入适量0.25%胰酶，37℃消化15～20min。胎牛血清终止消化，蓝枪头均匀用力吹打10～15次，200目细胞筛过滤形成单细胞悬液。离心，弃上清液，加适量培养基吹打、重悬。重复一次离心、重悬步骤。细胞计数，以2×105/ml接种于6cm培养皿中，置培养箱中培养, 每2～3d半量换液1次, 6～7d传代1次。

1.2.3 传代培养：细胞悬液离心，弃上清液。Acctuase酶吹打、重悬，37℃消化10min。离心，去Acctuase酶，加培养基，均匀用力吹打30～50次，加入适量增殖培养基重悬。传代后培养方式同原代。

1.2.4 CCK-8检测NSCs初期增殖情况：取相应增殖培养基培养的第二代传代后的单细胞悬液，随机接种于96孔板中，每孔细胞数约为7 000个，每孔培养基100μl。各组同时培养24、48、72h后，每孔加入培养基10%体积的CCK-8原液，继续培养4h，之后用酶标仪在450nm处测吸光度反映细胞数情况。每组5孔，重复3次。

1.2.5 免疫荧光检测NSCs整体增殖情况：取相应增殖培养基培养的第二代传代后的单细胞悬液，培养7d后接种于多聚赖氨酸包被后的6孔板无菌爬片中培养4h以贴壁。经4%多聚甲醛固定，0.5%tritonX-100破膜，10%正常山羊血清封闭后。孵一抗抗Nestin(1∶200)4℃过夜。孵二抗Dylight488标记山羊抗小鼠(1∶100)37℃1h。DAPI染核，抗荧光淬灭封片剂封片。激光共聚焦下观，每组随机收集4张细胞爬片进行染色，物镜为20X下按时钟的3 点、6点、9 点、12 点和圆心5 个方位选取5个视野拍摄照片，并统计直径>100μm的神经球数量。统计同一视野内平均直径。

2 结果

2.1 原代培养形态 原代细胞接种后, 对照组与实验组皆可见分为几层悬浮的单个圆形细胞，边界清, 折光强，也可能有少量未吹打完全的组织存在。2～3d后,对照组少部分细胞成球生长，大部分仍为单细胞，死亡细胞较多，可见较多细胞碎片(见图1A)。实验组见大多数细胞显著增殖呈悬浮聚集成球生长，单个神经球的直径不超过50μm，少数单个细胞并见少量死亡的细胞(见图1a)。6～7d后，神经球通过增殖和融合周围小的神经球变大，其中对照组神经球较小且数量较少，大多数大球中心颜色暗淡，营养不良(见图1B)。实验组单个神经球直径可达到150～300μm，多呈球形、桑葚状，且透光性强(见图1b)。

图1 不同培养基及时间下原代NSCs形态

A.对照组原代培养第3天 B.对照组原代培养第7天 a.实验组原代培养第3天 b.实验组原代培养第7天

2.2 初期增殖 CCK-8结果表明，培养24h、48h、72h后，对照组OD值各个时间点均低于实验组OD值(P<0.05)。通过OD值可表明，实验组在初期增殖的细胞数明显大于对照组。具体统计数据见表1。

表1 CCK-8结果OD值

2.3 整体增殖 首先，细胞Nestin表达呈阳性，证明两组培养的细胞皆为NSCs。其次，对照组的神经球数量为(9.15±3.58)个，实验组的神经球数量为(20.75±5.06)个，实验组数量明显高于对照组(P<0.05)。最后，对照组神经球平均直径为(122.50±40.72)μm，实验组神经球平均直径为(193.50±29.54)μm，实验组平均直径明显大于对照组(P<0.05)。代表性图见图2。

图2 免疫荧光图

绿色荧光标记Nestin阳性细胞，蓝色荧光标记细胞核 A.实验组，神经球形态正常 B.对照组，可见部分神经球内部细胞开始凋亡无法被Nestin抗体标记，呈黑色

3 讨论

外源性神经干细胞培养的来源较多，少部分来源于成体细胞[10]，大部分以胚胎来源为主，因为其干细胞比例较大，细胞增殖较快[11]。我们往期也选用胚胎来源的细胞[12-14]，然而多年实际操作中发现存在细胞绝对量少需要杀死多个胚胎，血管及脑膜分离难度大，杂质细胞较多，取材过程烦琐细胞死亡量大等问题。在查阅近期相关文献后[15]，我们决定尝试更接近胚鼠的24h新生鼠，并选择适宜培养基。

表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)主要用于维系干细胞特性的丝裂原[16]。EGF可促进长期存活，而bFGF可对分化起一定作用[17]。当它们共同添加到培养基时可促进分裂增殖并且抑制分化，其作用与两者浓度呈协同关系，20ng/ml时其促分裂作用最强[18]。不含生长因子的Neurobasal培养基已被我们证明适用于胎鼠来源。因此我们猜测，针对新生鼠来源，不含生长因子的Neurobasal培养基与含生长因子的DMEM∶F12培养基二者是否存在差异，哪种培养基更适合新生鼠来源。

巢蛋白(Nestin)被认为是神经干细胞的特异性标志蛋白之一，被广泛应用于鉴定，因为只要细胞开始向神经元和胶质细胞分化时，该蛋白便会停止表达。本实验通过形态学分析与Nestin鉴定表明两种培养基皆可成功培养出新生鼠大脑皮层来源的神经干细胞。通过CCK-8与神经球数量的统计学分析，含有因子的培养基更能促进细胞的增殖。总体上说，本实验旨在建立一套成熟的新生鼠大脑皮层来源的神经干细胞原代、传代培养体系，提供具有良好增殖与活性的神经干细胞，为之后进一步的相关增殖、凋亡、分化、移植等实验打下良好的基础。