瑶药心叶紫金牛提取工艺优化及2种成份含量测定

丁 聪，陈 俊，潘 敦，何亚骏，邓燕萍，柳贤福

(广西中医药大学赛恩斯新医药学院，中国 南宁 530222)

紫金牛科植物心叶紫金牛Ardisiamaclurei的全株，为瑶药传统老班药(经典瑶药)“七十二风”中的一种——走马风[1]，瑶药称之为yangh maz buerng(养马崩)，别名小马胎、红云草、红铺地毯、铺地走马。微苦、涩、平，属“风药”，生长于海拔230～860 m 的密林下或水旁、石缝间阴湿处，分布于广西、海南、贵州、广东、台湾等省区[2]。广西主产区为蒙山、昭平、金秀、藤县、平果、龙胜、恭城、都安、罗城、武宣、兴安等县市[3，4]。走马风具有调经通络、活血止血、消肿止痛及镇咳祛痰的作用，瑶医多用于妇女月经不调、痛经、产后恶露不尽、产后体虚等多种妇科常见病的治疗[5-9]。该药的活性成分主要有皂苷类、苯醌类、苯酚类、香豆素类、黄酮类、三萜类等[10，11]。本文采用HPLC法对心叶紫金牛中岩白菜素和汉黄芩素[12，13]的含量进行同时测定，为瑶药心叶紫金牛质量评价提供参考依据，有助于研究和开发广西民间药用资源。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱法( 安捷伦科技有限公司)，AL204梅特勒万分之一电子天平(梅特勒托利多)，JWS-12恒温水浴锅(上海锦玟仪器设备有限公司)。岩白菜素(批号5759，纯度≥98.0%，检测方法：HPLC)、汉黄芩素(批号5325，纯度≥98.0%，检测方法：HPLC)购于上海诗丹德标准技术服务有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水(Millipore Simplicity-185超纯水仪，美国密里博公司)，其余试剂为分析纯。6批药材中有3批购自制药公司(见表1)，另外3批于2019年3月自行采收：S4采自广西南宁，S5采自广西百色，S6采自广西河池。经广西中医药大学赛恩斯新医药学院生药教研室苑敏副教授鉴定均为紫金牛科植物心叶紫金牛Ardisiamaclurei的干燥根。

表1 心叶紫金牛药材信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；检测波长为274 nm；流动相为甲醇(B)-0.2%磷酸(A)系统，梯度洗脱(0～10 min，30%B；10～20 min, 30%→80%B；20～30 min，80%B)；流速为1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

精密称取105 ℃干燥至恒重的岩白菜素、汉黄芩素对照品适量，加甲醇制成含岩白菜素0.272 g·L-1、汉黄芩素0.148 g·L-1的混合对照品溶液。取心叶紫金牛药材粉末(过0.425 mm筛)约1 g，精密称定，精密加入甲醇溶液20 mL，称取质量，超声提取30 min，放冷，用甲醇溶液补足减少的质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.3 专属性试验

分别精密吸取“2.2”项下对照品混合溶液和供试品(S1)溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，结果见图1。

图1心叶紫金牛样品(A)和混合对照品图谱(B)

Fig.1Sample chromatogram(A) and mixed reference substance chromatogram(B)

2.4 供试品处理的正交试验

根据对样品的单因素考察结果以及岩白菜素和汉黄芩素的性质，选定以甲醇为提取溶剂进行超声提取。采用正交试验L9(34)，选择甲醇质量分数(A)、甲醇用量(B)、提取时间(C)3个因素，每个因素设3个水平[14]，对心叶紫金牛药材进行提取工艺研究，以岩白菜素和汉黄芩素的含量为评价指标，正交设计表及分析结果见表2～4。

表2 正交设计因素水平表

表3 白菜素和汉黄芩素L9(34)正交试验直观分析表

表4 白菜素和汉黄芩素方差分析表

因素极差R越大，说明因素的水平改变对实验结果影响也越大。根据表3可知，各实验因素对岩白菜素和汉黄芩素提取效果的影响顺序为A>B>C。由表4可知因素A(甲醇质量分数)P<0.05，因素A具有统计学意义，说明甲醇质量分数对试验结果有显著性影响，综合直观分析和方差分析的结果，考虑到实际生产成本等问题，确定最佳提取方法为A3B1C1，即用20 mL 100%甲醇溶液超声提取30 min。

为验证优选工艺A3B1C1的可靠性和合理性，进行验证试验：取3份S1粉末，按“2.1”项下所述方法进行测定，结果岩白菜素平均含量5.032 4 mg·g-1，RSD值=1.06%，汉黄芩素0.505 7 mg·g-1，RSD值=1.69%。表明本实验优化的工艺具有一定的稳定性，说明优化成功。

2.5 线性关系考察

精密吸取2.2项下对照品混合溶液1，4，8，12及16 μL，按2.1项下的色谱条件用高效液相色谱仪测定峰面积(见表5)。以对照品溶液进样量(μg)为横坐标，其色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，见图2，得出岩白菜素回归方程为y= 1 713.1x- 77.373，R2= 0.999 1；汉黄芩素回归方程为y= 1 293.1x+ 4.342，R2= 0.999 5。结果表明岩白菜素和汉黄芩素在进样量分别为0.272～4.352 μg和0.148～2.368 μg时呈良好的线性关系。

表5 线性关系考察结果

图2标准工作曲线图(A岩白菜素，B汉黄芩素)

Fig.2Standard working curve(Bergenin(A)， Wogonin(B))

2.6 精密度试验

精密吸取S1供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件，连续进样6次，测定样品中岩白菜素和汉黄芩素的峰面积，其RSD值为0.80%和1.36%(见表6)，表明所用高效液相色谱仪的精密度好。

表6精密度试验结果

Tab.6Precision test results

成分峰面积123456RSD值/%岩白菜素4 196.54 190.34 148.14 220.74 130.34 170.30.80汉黄芩素374.3373.7370.7369.3365.4380.21.36

2.7 重复性试验

取S1心叶紫金牛药材粉末6份，每份1 g，精密称定，按2.2项下供试品制备方法制备，按2.1项下的色谱条件，精密吸取供试品溶液10 μL进行分析，计算岩白菜素和汉黄芩素的含量，其RSD值为1.12%和1.52%(见表7)。结果表明，用上述方法测定岩白菜素和汉黄芩素的含量，重复性好。

表7 重复性试验结果

2.8 稳定性试验

取S1心叶紫金牛药材粗粉约1 g，精密称定，按2.2项下方法制备溶液，室温下保存，分别在0，2，6，10，16及24 h精密吸取样品溶液10 μL注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件测定，考察其稳定性。结果测得样品中岩白菜素和汉黄芩素峰面积RSD值为0.97%和1.38%(见表8)，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

表8 稳定性试验结果

2.9 加样回收率试验

取已知含量S1心叶紫金牛药材粉末约0.5 g，精密称定，精密加入20 mL甲醇溶液，分别精密加入一定量的2个成分对照品(加入量分别为样品含量的80%，100%和120%)。按2.2项下方法制备，各平行制备3份，按2.1项下色谱条件分别测定含量，结果见表9。实验结果可知，岩白菜素和汉黄芩素的平均加样回收率为99.40% 和98.91% (RSD值为1.30%和1.28%)。

表9加样回收试验结果(n=9)

Tab.9Sample recovery test results(n=9)

化合物样品量/g已知量/mg加入量/mg测得量/mg加样回收率/%平均加样回收率/%RSD值/%岩白菜素0.501 62.526 62.024.533 599.350.502 52.531 12.024.523 698.640.502 72.532 12.024.499 297.380.502 22.529 62.525.025 599.040.503 22.534 62.525.045 999.650.506 22.549 72.525.032 198.510.502 92.533 13.065.579 299.550.507 22.554 83.065.634 2100.640.506 62.551 73.065.668 9101.8799.401.30汉黄芩素0.501 60.253 40.205 00.457 599.560.502 50.253 9 0.205 00.453 897.530.502 70.254 00.205 00.459 1100.070.502 20.253 70.253 00.504 499.090.503 20.254 20.253 00.510 1101.140.506 20.255 70.253 00.504 198.170.502 90.254 10.316 00.568 299.410.507 20.256 2 0.316 00.564 397.490.506 60.255 90.316 00.564 897.7498.911.28

2.10 样品测定

分别取广西不同产地心叶紫金牛药材粉末(每个产地各3份)约1 g，精密称定，按2.2项下方法制备样品，按2.1项下色谱条件，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪测定，实验结果见表10。

表10 不同产地心叶紫金牛药材含量测定结果(n=3) 单位：mg·g-1

3 结论与讨论

(1)通过预试验发现，超声提取法和加热回流提取法测得岩白菜素和汉黄芩素的含量相近，考虑到回流提取操作较超声提取繁琐，故选择超声提取法。对比乙醇溶液和甲醇溶液提取效果，结果显示乙醇提取液图谱峰型较差，因此选择提取效果好的甲醇作为提取溶剂。通过DAD检测器3D图谱扫描[15-17]，发现在274 nm波长处岩白菜素和汉黄芩素吸收最佳，故选择274 nm作为测定波长。

(2)心叶紫金牛的化学成分研究表明其含有岩白菜素和汉黄芩素，但尚未有这两种化合物提取工艺及同时测定两种含量的相关报道。岩白菜素和汉黄芩素是该药材的主要活性成分，故选择其作为测定指标[9,10]。本实验发现，心叶紫金牛药材中岩白菜素含量较高，汉黄芩素含量相对较低。不同产地间成分差异较大，本研究结果可为今后心叶紫金牛药材的开发利用和质量控制提供一定的参考依据。