藏药止泻木子挥发油超临界提取工艺、GC-MS分析及抑菌活性研究

南措吉，李毛加，张金魁，扎西吉，南杰东智，才让南加

( 1.青海民族大学药学院，中国 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学重点实验室，中国 西宁 810007；3.青海省玉树州藏医院，中国 玉树 815099)

止泻木子SEMEN HOLARRHENAE(藏语称“土膜钮”)为传统藏药药用植物，是夹竹桃科植物止泻木HolarrhenaantidysenteriacaWall. ex A. DC.的干燥种子[1,2]，属常用藏药品种，味极苦，性凉，治所有赤巴热症，尤其对胆囊热症和热型痢疾肠道虫病有奇效[3]。

现代研究发现止泻木子中含有锥丝碱、异锥丝明、锥丝亚胺等多种生物碱类成分[4]。止泻木子科属植物具有抗菌、消炎等活性[5]。耿金峰[5，6]等发现止泻木子粗提物和总生物碱对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等6个菌种有明显的抑菌作用，且总生物碱对细菌的抑制作用优于粗提物，但是未见对止泻木子的挥发油提取工艺和其抑菌活性的相关研究。为此，本文对藏药止泻木子挥发油提取工艺及其抑菌活性开展了相关研究工作，并利用GC-MS分析了挥发油主要化学成分。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

7071型超临界CO2萃取仪，Series1500夹带剂泵、萃取釜、空压机和SDC-6冷循环水系统；GC/MS联用：美国Agilent公司7890A/MSD5975C；Agilent公司G1888顶空进样器；四极杆质谱检测器；质谱检索数据库：NIST08 MS search 2.0；MSD Chemstation D.03.00.611色谱数据处理系统(美国Agilent公司)；Applied Separations(美国分离技术公司)。

1.2 试药

止泻木子(购买于青海省西宁市八一路药材市场，经青海民族大学药学院才让南加教授确认为印度止泻木子)。

1.3 菌株

甲型副伤寒沙门菌Salmonellaparatyphi-A，宋氏志贺氏菌Shigellasonnei， 金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus,短小芽孢杆菌Bacilluspumilus,藤黄微球菌Micrococcusluteus，乙型副伤寒沙门菌SalmonellaparatyphyB，痢疾志贺氏菌Shigelladysenteriae，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，大肠埃希菌Escherichiacoli，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus，白色念珠菌Candidaalbicans,黑曲霉Aspergillusniger，酿酒酵母菌SaccharomycescerevisiaeHansen。

2 实验方法

2.1 SFE-CO2萃取实验方法

将止泻木子粉碎，过0.18～0.25 mm筛使粒度一致，称取止泻木子粉末，每个萃取釜中加入28.0 g样品，将萃取釜连接到萃取装置中。加热使萃取釜达到实验设定温度，通入二氧化碳检查密闭性，如气密性完好则进行加压萃取。静态萃取15 min后动态萃取并收集挥发油。以萃取压力、萃取温度、萃取时间为考察因素,见表1。

表1 正交试验设计表

2.2 GC-MS分析

气质联用条件： 气相色谱柱为HP-5弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；进样口温度条件为250 ℃，辅助区温度条件280 ℃；采用手动进样方式，进样量10 μL，重复进样3次；分流比为20∶1；载气为(流量)He (0.8 μL·min-1)；程序升温条件：起始温度为40 ℃，持续5 min。以3 ℃·min-1升温至40 ℃，运行时间为5 min，保持5 min；以2 ℃·min-1升温至280 ℃，运行时间为70 min，恒温保持570 min；质谱检测器条件为：FID温度设定条件为250 ℃，电离方式EI：70 eV；扫描范围为m/z：50～550 amu；质谱检索标准库为NIST08 MS search 2.0 数据库。

2.3 抑菌实验

取1 μL超临界萃取的止泻木子挥发油样品融入1 mL DMSO溶剂中备用。前期制备好pH7.2～7.4的营养琼脂培养基，通过紫外灭菌25 min后接种14个不同菌种，30～35 ℃ 培养24 h，制备1011cfu·L-1的孢子悬液，测定样品和阳性对照品、阴性(空白)对照品的抑菌圈大小。

3 结果与分析

3.1 止泻木子挥发油提取工艺研究

超临界CO2萃取止泻木子挥发油工艺参数的正交优化实验结果见表2。从分析结果可知, 萃取压力、温度、时间三因素的方差值分别为1.38，1.33和1.23, 表明萃取压力对挥发油萃取率影响最显著，影响从大到小的顺序为萃取压力、萃取温度、萃取时间，见表2。

表2 正交试验结果

本研究以止泻木子为研究对象，通过提取工艺的筛选，确定了该药挥发油的超临界CO2最佳萃取工艺参数为萃取压力25 MPa，萃取温度40 ℃，萃取时间2.3 h。在此条件下萃取挥发油平均得率为6.8%。

3.2 止泻木子挥发油主要化学成分鉴定

通过GC-MS对止泻木子挥发油进行分析测定和结构鉴定，总共分离出可识别峰119个，确定了10种含量较高的化学成分，其中十二甲基环六硅氧烷保留指数高且含量在22%以上，为止泻木子挥发油中的主要成分之一，见表3。

表3 止泻木子中挥发油主要化学成分

3.3 止泻木子挥发油抑菌作用研究

通过观察是否出现抑菌圈，发现止泻木子挥发油对14个菌种有不同程度的抑菌效果，其抑菌情况如表4所示。

表4 止泻木子提取物对不同菌种的抑菌情况

注：+表示有抑菌圈，-表示没有抑菌圈。

止泻木子挥发油对上述5种细菌有不同程度的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌、宋氏志贺氏菌和短小芽孢杆菌的抑菌率分别为82.8%，64%及40.7%，表示在相同的浓度下止泻木子对金色葡萄球菌的抑菌效果较好，见表5。相同浓度下止泻木子对白色念珠菌和黑曲霉的抑菌效果较好，但是对酿酒酵母菌无抑菌作用，见表6。

表5 止泻木子挥发油对11种细菌的抑菌效果

注：A 阳性对照物为氨苄青霉素钠，B阳性对照物为硫酸庆大霉素。

表6 止泻木子挥发油对3种真菌的抑菌效果

4 讨论

通过前期对提取条件的摸索发现，止泻木子中的挥发油很难用水蒸气蒸馏，相比之下，超临界二氧化碳萃取法(SFE-CO2)提取止泻木子挥发油具有速度快、产油率高等特点。本实验采用SFE-CO2萃取，在萃取压力为25 MPa，萃取温度为40 ℃，萃取时间为2.3 h的条件下得油率最高，是最优萃取条件。GC-MS分析发现止泻木子挥发油中化学成分种类少，但相对含量较高。

《晶镜本草》[3,7]记载止泻木子对热性痢疾具有特效，而热性痢疾在患者症状表现上与细菌感染性腹泻高度相似，临床上细菌感染性腹泻按热性痢疾诊治。热性痢疾在临床上以发热、腹痛、腹泻、里急后重及排含黏液、脓血的稀便为主要症状。通过抑菌实验发现，藏药止泻木子对细菌和真菌均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌和宋氏志贺氏菌的抑菌效果最强，而临床上细菌性感染的腹泻患者中，金黄色葡萄球菌和志贺氏菌感染者多见[9-12]。江华超[13]等通过研究病理切片观察发现志贺氏菌对小鼠具有很强的致病作用，该菌会引发多种器官及肠道充血或出血。喜杰[14]等对止泻木子的药理研究发现以止泻木子为主的方剂在小鼠实验中对治疗腹泻效果显著。由此笔者推测止泻木子治疗热性痢疾的机制可能是通过抑制葡萄球菌和志贺氏菌来起效，这有待进一步验证。