BDNF Val66Met（rs6265）单核苷酸多态性与针刺个体疗效差异的相关性研究＊

王越月，赖小燕，张宇叶，吴 双，武 平，兰 蕾

（成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610075）

偏头痛是临床常见的原发性头痛之一，同时被评为第2大致残性疾病[1]。严重者往往疼痛难忍，常常影响身体及生活质量[2]。该病在女性中的流行至少是男性的3 倍，其中大约50%的病人头痛发作与月经周期密切相关[3]。长期的西药治疗会带来一系列副作用，而针刺在偏头痛的治疗中疗效显著且副作用小。偏头痛是针刺的优势病种，具有悠久的应用历史。现代临床研究也进一步验证了针刺对偏头痛具有良好的治疗效果[4-12]。然而，个体疗效差异现象普遍存在，研究针刺的个体疗效差异对于科学解释针刺效应有着的重要意义。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是广泛分布在中枢神经系统中的一种蛋白质，被认为是介导疼痛的重要调节因子，不仅参与了疼痛回路中与活动有关的突触可塑性，而且在痛觉中枢敏化的发生、发展与维持中发挥作用[13]。在神经病理性疼痛状态下，增多的BDNF 主要表达于活化的小胶质细胞。研究表明，BDNF水平升高与疼痛抑制效率降低显著相关[14]。在多个基因多态性位点的BDNF基因中，BDNF Val66Met 是与调节疼痛有相关性的基因位点[15]，Val66Met 突变导致活性依赖性的 BDNF 分泌水平降低，影响大脑皮质的疼痛处理。有研究表明脑源性神经营养因子BDNF Val66Met 多态性与偏头痛的发病风险具有显著相关性[16]。因此，本文拟从BDNF Val66Met 的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）角度来探讨月经性偏头痛患者的针刺个体疗效差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择 2015 年 10 月至 2016 年 10 月于成都中医药大学公开招募的患者，经临床诊断为月经性偏头痛，共70例；根据针刺治疗前后的“头痛天数”差值与治疗前头痛天数的比值来评价针刺疗效，以进行针刺疗效分组：比值大于0.5 者，归为针刺有效组；小于0.5 者，则归为针刺无效组。将患者的一般资料及病情资料进行比较（表1、表2），无统计学差异（P＞ 0.05），符合基线均衡性，具有可比性。

1.2 纳入标准与排除标准

纳入标准：右利手，18-50岁；符合2013年IHS国际头痛分类第三版（IHCD-III）中无先兆偏头痛的诊断标准[17]；偏头痛发生于月经前2 天后3 天内，并且发病史至少半年，最近1 个月内有过偏头痛；近3 个月未进行阿米替林、多虑平、马普替林等抗焦虑抑郁类等药物治疗；最近1个月肝肾功、血常规等各项血液指标均不见明显异常；腹部B 超、心电图检查均不见明显异常，生命指征平稳；近2 周未进行偏头痛预防药物治疗；心理学量表即焦虑自评量表（SAS）与抑郁自评量表（SDS）评分指数均小于0.5，则无焦虑、抑郁情绪，神志清楚，无言语及意识障碍，能配合治疗者；无针灸禁忌；自愿参加本研究，签署知情同意书，并有良好的依从性。

排除标准：严重痛经、妊娠或哺乳期妇女，过敏体质者；合并有高血压、糖尿病、冠心病等重大疾患。

1.3 针刺干预

针灸针：选用新杏林一次性针灸针（生产商：北京天宇恒科技有限责任公司，生产许可证：津食药监械生产许20100025 号），规格（直径×长度）为Φ 0.25 mm ×25 mm、Φ 0.25 mm×40 mm两种类型。

选穴及用穴依据：依照《新世纪全国高等中医药院校规划教材·针灸学》[18]选用双侧的外关、阳陵泉、丘墟进行治疗。

针刺干预：本治疗共 20 次，分为 4 个疗程，1 个疗程为1 周（每天治疗1 次，连续治疗5 天后休息2 天），每次治疗0.5 h。

1.4 观察指标

针刺前后分别进行1次临床观察指标评价，包括：头痛天数、偏头痛特异性生活质量问卷[19]（migrainespecific questionnaire，MSQ）、焦虑自评量表[20]（self-rating anxiety scale，SAS）以及抑郁自评量表[21]（self-rating depression scale，SDS）。

1.5 SNP检测

所有受试者治疗前均接受1 次血样采集，进行BDNF 基因多态性位点的检测，由美国应用生物系统公司所生产的7500 型荧光定量PCR 仪（7500 real time PCR system)、美国应用生物系统公司提供的标准SNP基因分型分析试剂、实时荧光PCR 试剂、探针试剂以及随机附赠的软件Sequence Detection System 2.3 分析来完成。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学处理。对偏头痛针刺受试者的一般资料和病情资料等计数资料采用卡方检验，满足正态分布的计量资料采用方差分析或t检验；不满足正态分布的计量资料采用非参数检验。对偏头痛针刺受试者的基因型频率进行卡方检验；对不同基因型偏头痛针刺受试者的病情资料采用方差分析，运用单因素方差分析进行多组间的均数比较，两组组间分析用独立样本t检验，检验水准α=0.05，数据采用均数 ± 标准差（）的形式表示，采用双侧检验，P＜0.05具有统计学差异。

2 结果

本次试验共纳入70 例，由于治疗期间有3 人由于时间冲突脱落研究过程中脱失，脱失病例3例，脱失率4.28%，符合计划规定的样本脱失率。最终全部收治病例及完成样本采集67 例，其中针刺有效组26 例，无效组41例。

2.1 针刺有效组与无效组的基线期病情比较

比较针刺受试者的一般资料，无统计学差异（P＞0.05），符合基线均衡性，具有可比性，详见表1。

2.2 针刺治疗前后有效组和无效组病情资料比较

针刺治疗前有效组与无效组在头痛天数、SAS 评分、SDS评分和MSQ-功能受限、MSQ-功能丧失、MSQ-情感功能资料的比较，无统计学差异（P＞0.05），符合基线均衡性，具有可比性，详见表2。

针刺治疗后有效组与无效组在头痛天数、SAS 评分和MSQ-功能受限、MSQ-功能丧失、MSQ-情感功能资料比较差异有明显统计学意义（P＜0.01）。而SDS评分差异未发现统计学意义（P＞0.05），详见表3。

针刺治疗有效组的头痛天数、SAS 评分、SDS 评分以及MSQ-功能受限、MSQ-功能丧失、MSQ-情感功能治疗前后资料比较，在治疗后均有所改善，且差异具有显著统计学意义（P＜ 0.01），详见表4。

针刺治疗无效组的头痛天数、SAS 评分、SDS 评分以及MSQ-功能受限、MSQ-功能丧失、MSQ-情感功能治疗前后资料比较，未发现统计学差异（P＞0.05），详见表5。

2.3 BDNF Val66Met基因型与临床指标的相关性分析

采用实时荧光定量PCR TapMan 探针法对67例偏头痛针刺受试者BDNF Val66Met 的基因型进行鉴定，分布情况为：15 例为 Val/Val 基因型，37 例为 Val/Met基因型，15 例为Met/Met 基因型（图1）；其中针刺有效组 4 例为 Val/Val 基因型，16 例为 Val/Met 基因型，6 例为Met/Met 基因型（图2）；针刺无效组11 例为Val/Val基因型，21 例为 Val/Met 基因型，9 例为 Met/Met 基因型（图3）。

不同BDNF Val66Met基因型针刺受试者的头痛天数、SAS 评分、SDS 评分以及 MSQ-功能受限、MSQ-功能丧失、MSQ-情感功能资料比较，未发现统计学差异（P＞ 0.05），详见表6。

不同疗效的针刺受试者在BDNF Val66Met不同的基因型中分布人数比较未发现统计学差异（P＞0.05），详见表7。

不同BDNF Val66Met基因型针刺有效组在头痛天数、SAS 评分和SDS 评分的差异未见统计学意义（P＞0.05），但在MSQ 的3个方面评分差异具有统计学意义（P＜0.05）。再进一步两两比较后得出，在MSQ-功能受限方面 Met/Met 基因型与 Val/Val、Val/Met 基因型具有统计学差异（P＜0.05）；在MSQ-功能丧失、情感功能方面Val/Met 基因型与Val/Val 与Met/Met 基因型差异具有统计学意义（P＜ 0.05），详见表8。

表1 针刺受试者人口学信息分析（）

表1 针刺受试者人口学信息分析（）

人口学信息年龄身高体重针刺有效组(n=26)24±2.43 158.2±3.71 51±4.67针刺无效组(n=41)21.73±2.15 157.27±5.52 51.26±6.45双侧P值P ＞0.05 P ＞0.05 P ＞0.05

表2 针刺治疗前针刺有效组和无效组的病情资料比较（）

表2 针刺治疗前针刺有效组和无效组的病情资料比较（）

病情资料头痛天数（天）SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能针刺有效组(n=26)4.54±2.04 39.88±9.66 38.68±6.98 61.45±17.31 61.45±17.31 61.28±21.68针刺无效组(n=41)6.61±2.48 42.50±4.68 40.54±5.82 65.84±19.99 65.84±19.99 67.57±19.60 t值-1.29-1.29-1.18-0.92-0.92-1.23双侧P值0.14 0.21 0.24 0.36 0.36 0.22

表3 针刺治疗后针刺有效组和无效组的病情资料比较（）

表3 针刺治疗后针刺有效组和无效组的病情资料比较（）

注：*表示独立样本t检验有显著统计学差异。

双侧P值0.00*0.00*0.82 0.00*0.00*0.00*病情资料头痛天数（天）SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能针刺有效组(n=26)1.58±0.86 33.88±7.55 37.29±8.50 57.10±11.34 67.20±17.34 71.00±15.31针刺无效组(n=41)6.78±2.08 41.54±5.25 36.85±7.10 76.48±14.28 89.98±11.49 85.02±14.82 t值-7.04-4.77 0.23 5.90 5.91 3.68

表4 针刺治疗有效组的前后病情资料比较（）

表4 针刺治疗有效组的前后病情资料比较（）

注：*表示独立样本t检验有显著统计学差异。

双侧P值0.00*0.00*0.00*0.00*0.00*0.00*病情资料头痛天数（天）SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能治疗前4.54±2.04 39.69±9.39 33.84±7.83 76.48±14.28 89.98±11.49 85.02±14.83治疗后1.58±0.86 33.84±7.83 30.83±7.21 57.91±17.45 61.45±17.31 61.28±21.68 t值10.79 6.59 4.83-5.62-6.80-4.77

表5 针刺治疗无效组的前后病情资料比较（）

表5 针刺治疗无效组的前后病情资料比较（）

病情资料头痛天数（天）SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能治疗前6.61±2.48 42.50±4.68 40.54±5.82 57.90±11.32 67.22±17.34 71.09±15.32治疗后6.78±2.08 41.51±5.21 36.85±7.09 56.65±13.82 65.84±19.99 67.57±19.60 t值2.44 1.51 2.89-1.38-1.48-1.71双侧P值0.15 0.14 0.06 0.18 0.15 0.09

表6 不同BDNF Val66Met基因型针刺受试者病情资料的比较（）

表6 不同BDNF Val66Met基因型针刺受试者病情资料的比较（）

注：P值为3组基因型间各项病情资料比较的结果；P1：Val/Val基因型与Val/Met基因型间各项病情资料比较的结果；P2：Val/Met基因型与Met/Met基因型间各项病情资料比较的结果；P3：Val/Val基因型与Met/Met基因型间各项病情资料比较的结果。

0.64 0.55 0.89 0.09 0.07 0.18基因型头痛天数SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能Val/Val(n=15)4.60±2.61 39.25±7.62 38.82±6.68 61.62±14.07 71.77±21.43 68.72±22.48 Val/Met(n=37)5.16±2.36 41.55±6.30 40.03±6.00 57.25±13.72 62.99±16.65 66.31±19.52 Met/Met(n=15)5.00±2.07 40.77±7.73 39.77±7.97 52.38±19.06 59.33±20.87 58.61±20.82 F P P1 P2 P3 0.3 1.28 0.18 1.40 1.80 1.05 0.74 0.28 0.83 0.25 0.17 0.35 0.43 0.12 0.55 0.34 0.13 0.70 0.82 0.40 0.69 0.29 0.52 0.22

图1 偏头痛针刺受试者不同基因型分布

图2 针刺有效组不同基因型的分布

不同BDNF Val66Met基因型针刺无效组在头痛天数、SAS 评分、SDS 评分、MSQ-功能受限和情感功能的差异无统计学意义（P＞0.05），在MSQ-功能丧失方面具有统计学差异（P＜0.05）。再进一步两两比较后发现，在MSQ-功能丧失和情感功能方面Val/Val 基因型与Val/Met 基因型具有统计学差异（P＜ 0.05），详见表9。

图3 针刺无效组不同基因型的分布

表7 针刺受试者在不同BDNF Val66Met基因型间的比较

3 讨论

3.1 选穴依据

我国古代医学认为偏头痛属于“头痛”、“头风”的范畴。从古代经典著作《灵枢·经脉》记载来看，足少阳胆经与手少阳三焦经在头面的循行路线主要是侧头部以及耳周，主张偏头痛主要与少阳经相关。所以本次试验选用少阳经的外关、阳陵泉、丘墟是有着深厚的理论基础。现代也有很多研究证实针刺这类穴位治疗偏头痛是非常有效的[4-12]。同时本次试验结果为不同BDNF Val66Met基因型的针刺有效受试者接受针刺治疗后所有的评价指标具有明显的统计学差异（P＜0.05），提示针刺上述的少阳经穴位能显著改善不同BDNF Val66Met基因型的针刺有效受试者的头痛天数、情绪状态以及生活质量。

3.2 针刺疗效差异的普遍性

虽然针刺治疗该病有着安全有效、副作用小、疗效高的优势，但大量研究发现仍有部分患者对针刺表现出不敏感性[22,23]，即针刺普遍存在个体疗效差异。《灵枢·论痛》[24]将产生该差异的原因归类为：“筋骨之强弱，肌肉之坚脆，皮肤之厚薄，腠理之疏密，各不同其于针石”；有相关研究指出针刺产生不同的镇痛疗效与不同遗传基因小鼠是具有相关性的[25]。所以如何从遗传学的角度来科学的看待和阐述针刺所产生的个体疗效差异的影响因素对于提高针刺疗效以及促进针刺治疗偏头痛的应用都有着重要的指导作用。

表8 不同BDNF Val66Met基因型针刺有效组病情资料的比较（）

表8 不同BDNF Val66Met基因型针刺有效组病情资料的比较（）

注：*表示独立样本t检验有显著统计学差异。P值为3组基因型间各项病情资料比较的结果；P1：Val/Val基因型与Val/Met基因型间各项病情资料比较的结果；P2：Val/Met基因型与Met/Met基因型间各项病情资料比较的结果；P3：Val/Val基因型与Met/Met基因型间各项病情资料比较的结果。

0.64 0.27 0.38 0.00*0.46 0.65基因型头痛天数SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能Val/Val(n=4)4.60±2.61 31.10±6.21 38.51±5.44 70.00±13.72 49.13±16.18 44.38±13.32 Val/Met(n=16)5.16±2.36 41.31±11.24 39.83±6.92 60.81±9.43 71.33±12.71 73.52±17.18 Met/Met(n=6)5.00±2.07 38.52±9.69 34.26±9.56 41.93±6.28 52.19±14.19 39.92±10.11 F P P1 P2 P3 0.30 1.58 1.23 4.86 0.00 13.18 0.74 0.22 0.30 0.02*0.00*0.00*0.43 0.08 0.74 0.29 0.00*0.00*0.82 0.57 0.13 0.02*0.00*0.00*

表9 不同BDNF Val66Met基因型针刺无效组病情资料的比较（）

表9 不同BDNF Val66Met基因型针刺无效组病情资料的比较（）

注：*表示独立样本t检验有显著统计学差异。P值为3组基因型间各项病情资料比较的结果；P1：Val/Val基因型与Val/Met基因型间各项病情资料比较的结果；P2：Val/Met基因型与Met/Met基因型间各项病情资料比较的结果；P3：Val/Val基因型与Met/Met基因型间各项病情资料比较的结果。

0.48 0.52 0.08 0.90 0.20 0.44基因型头痛天数SAS评分SDS评分MSQ-功能受限MSQ-功能丧失MSQ-情感功能Val/Val(n=11)4.55±2.94 42.25±5.70 38.93±7.32 58.57±13.52 80.00±16.88 77.58±18.20 Val/Met(n=21)5.67±2.22 42.15±4.65 40.10±5.36 54.49±15.92 56.64±16.74 60.83±19.78 Met/Met(n=9)5.33±2.55 43.61±3.56 43.32±4.08 59.36±8.17 70.00±20.61 71.07±16.06 F P P1 P2 P3 0.72 0.31 1.63 0.52 6.63 3.11 0.49 0.73 0.20 0.59 0.00*0.05 0.23 0.95 0.58 0.43 0.00*0.02*0.74 0.44 0.15 0.38 0.06 0.17

3.3 BDNF Val66Met多态性与针刺疗效差异的相关性

研究BDNF Val66Met多态性与针刺治疗偏头痛所产生的个体疗效差异的相关性具有可行性。不仅可以从遗传学的角度解释针刺疗效会产生个体差异与遗传因素的内在联系，而且更能指导针灸治疗疾病在临床上的应用，提高针灸治疗临床疾病的有效率。BDNF 是体内含量最多的神经营养因子，能促进神经细胞的增值、再生、突触重塑及调节神经递质的释放等作用。BDNF 在很多人类和动物研究中被认为在介导疼痛回路内的感觉神经传递中有着重要作用[26]，参与着疼痛回路中与活动有关的突触可塑性。Tanure等人[27]发现血清BDNF 在偏头痛发作期增加，且明显高于无头痛时期的水平。BDNF 基因具有多个基因多态性位点，其中编码区的第66 位密码子鸟嘌呤-腺嘌呤（G-A）碱基置换所致缬氨酸（Val）被蛋氨酸（Met）代替（Val66Met）的单核苷酸多态性[28]（NCBI 美国国家生物技术信息中心SNP编码为rs6265），是人类可遗传的变异中最常见也是研究最多的一种[29]。现有研究发现BDNF rs6265 的不同基因型与药物过量性头痛患者每月用药量[30]、海洛因依赖者海洛因的用量[31]、帕金森病认知衰退程度[32]等疾病都密切相关。Zhili[33]等人发现BDNF Val66Met Met/Met 基因型的恐慌症患者预期焦虑严重程度高于Val/Val 基因型患者。同时有更多的文献表明BDNF Val66Met多态性与偏头痛发病率以及病情的严重程度有着显著相关性：Coskun等人[34]发现在土耳其人群中的BDNF 基因中Met 等位基因的患偏头痛率略高；Terrazzino 等人[16]表明降低大脑中BDNF 蛋白水平的Met 等位基因的载体，可能会增加偏头痛的可能性。在本试验得出的结果中，针刺有效组与无效组不同BDNF Va166Met 基因型的分布未发现明显差异（P＞ 0.05），但在不同BDNF Va166Met基因型两组的MSQ评分中有统计学差异（P＜0.05）：针刺有效组Met/Met 基因型在MSQ-功能受限的情况优于Val/Val 和Val/Met 基因型（P＜ 0.05），但是在其他的结局指标以及针刺无效组中里无差异；针刺有效组Val/Met 基因型在MSQ-功能丧失和情感功能的功能情况远不及Val/Val 和Met/Met 基因型（P＜ 0.01），但与此同时在针刺无效组的这两个评价指标中，Val/Met基因型的功能情况却明显优于Val/Val基因型（P＜0.05），同时与Met/Met 基因型相比功能情况略好，但差异没有统计学意义。这方面的结果可能说明了针刺疗效在不同疗效差异的群体中呈现出了基因型差异的趋势。

本次试验采用单核苷酸多态性分析技术，分析了BDNF Val66Met（rs6265）多态性与针刺疗效差异的相关性，但因样本量偏小，只能从结果中得出一个趋势性的描述，以期为相关研究提供一定的思路。希望在后续的研究中扩大样本量，得到一个更确切的结论。