基于网络药理学探讨大柴胡汤对2型糖尿病的治疗作用机制＊

赵 凯，许筱颖

（北京中医药大学中医学院 北京 100029）

近年来，由于分子生物学以及各种先进的组学技术逐渐被应用到中医药的领域中，在药理学分子作用机制研究和临床应用中已经积累了大量的实验研究数据[1]；随着大数据时代的到来，深度挖掘和整合这些已有的中医药相关医学数据，可以做到节约实验资源，为下一步中医药现代化和新药研发提供思路[2]。中医复方往往由几种至几十种中草药组成，每种草药都包含了几十种甚至上百种化学成分，因此由一张中医复方制成的汤剂可能含有成百上千种化合物，不同的组分之间呈现出复杂的相互作用。中药配伍的“七情”理论对不同中药之间配伍可能出现的不同情况做出了很好的诠释和归纳，如“相须”和“相使”表明两种药物会产生协同作用而增强疗效，“相畏”和“相杀”会产生减毒的效果，如果两种药物“相反”则意味着将两种药同时使用会产生毒性。从现代药理学的角度看“七情”理论，则可以认为是各草药所含的化学物组分之间产生了相互作用。由于所含的化合物数量众多且相互作用十分复杂，而通过提取分离的单一活性化合物和中药复方的作用效果在实际中又相去甚远，化合物和中医配方之间存在很大的差异；虽然从中药中提取单体制成的药物也能取得巨大成功，例如从青蒿中发现了青蒿素，但是阐明中药复方不同组分之间的相互作用及药理机制仍是十分必要的，只通过传统药理学实验的方法难以胜任。由于疾病具有复杂性，一种疾病可能同时涉及多个病理途径，如内分泌系统疾病，一个病理途径又与多个基因靶点和蛋白质相互作用有关。如糖尿病从开始胰岛功能异常到最终出现各种并发症，涉及多种途径和多个系统，如果仅仅依靠单一成分单一靶点药物去治疗多靶点的疾病是不现实的[3]。

现代网络药理学通过网络分析的方法寻找和构建药物与疾病之间多靶点的作用关系，为阐明中药复方的药理机制和新药发现提供了有利途径[4]；有研究者就曾通过网络分析发现了新的抗癌药物[5]。近年来，网络药理学方法被广泛引入到中医药领域的药理及病理的研究和分析中，如通过网络药理学构建的栀子大黄汤治疗肝病的网络模型，找到了多个潜在的作用靶点及相应化合物[6]；通过结合基因、蛋白质等测序实验数据，对芪参益气方构建网络模型进行分析，发现全方配伍使用的疗效高于其中任何单一使用的药味[7]。网络药理学方法与中医“整体观”“辨证论治”的思想不谋而合[8]，搭建起了传统中医药和现代医学之间沟通的桥梁[9]，网络上开放获取的中医药数据库和多种组学数据库，极大促进了多靶点药物疾病网络构建分析的便捷性。

糖尿病是我国常见的慢性代谢性疾病，据统计中国的糖尿病患者有1.14 亿之多，又因为我国人口基数巨大，伴随社会的逐渐老龄化趋势，使我国成为了世界上的糖尿病大国，糖尿病防治成为了亟待解决的重大民生问题，如何有效防治糖尿病在当今仍然是医学难题[10,11]。临床上主要多见2 型糖尿病（Type 2 diabetes），2 型糖尿病大约占到了90%左右，除2 型糖尿病之外，还有1型糖尿病，特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病[12,13]。中医复方具有“多组分、多靶点、多作用途径”的特点以及中医诊疗的整体观和辨证论治思想，中医药在治疗糖尿病方面有独到之处，值得深入研究和挖掘。有研究者曾运用网络药理学的方法分析了葛根芩连汤治疗糖尿病的分子网络作用机制，并用实验进一步验证了其中的关键活性成分[14]。中医经典《伤寒论》是中医辨证论治思想的源头，具有极高的学术地位，被历代名家奉为圭臬。大柴胡汤是《伤寒论》中一首著名方剂，为小柴胡汤去人参加枳实、芍药、大黄而成，去掉了人参之补，增加了宣通之力，主要功效是用于治疗少阳和阳明合病，有和解少阳、内泻里热的作用。近年来，大柴胡汤的临床应用得到了扩展和深化，广泛用于治疗胃肠道等消化系统疾病，并且对糖尿病及其并发症和高脂血症方面也有很好的效果[15]。有临床研究表明，大柴胡汤治疗超重2 型糖尿病与西药二甲双胍有类似的疗效[16]。大柴胡汤改善了糖尿病患者的症状，降低了血糖和血脂等指标，值得临床推广使用[17]。由于大柴胡汤药效成分复杂，其对糖尿病治疗作用的分子机制仍不是很清楚。本文运用网络药理学和生物信息学方法直观的分析大柴胡汤复方的作用机制，系统阐释和挖掘中医经典方剂大柴胡汤对2 型糖尿病的治疗作用机理，以期为进一步的实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 大柴胡汤和2型糖尿病潜在靶点检索

首先将大柴胡汤中的8味中药：柴胡、黄芩、白芍、半夏、枳实、生姜、大枣、大黄依次输入中医药生物信息分析平台SymMap[18]（https://www.symmap.org/search/），得到预测的大柴胡汤的有效化学成分和靶标，将大柴胡汤中的每味药分别依次输入到平台中，设置搜索条件为P＜0.05。通过在CTD 数据库[19]（Comparative Toxicogenomics Database, www. ctdbase. org）中 搜 索“Diabetes Mellitus,Type 2”，即可获得预测出的2 型糖尿病有关的靶点，将其导入到Excel 表格中按“Inference Score”从高到低排序，保留具有直接证据的靶点。

1.2 药物-疾病靶点筛选

通过预测获得大柴胡汤的所有潜在靶点和2型糖尿病的相关靶点，将两组数据分别输入到韦恩图绘制工具[20]（Calculate and draw custom Venn diagrams,http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）软件中，即得到大柴胡汤和2 型糖尿病的重叠作用靶标，即为得到的药物-疾病靶点。

1.3 药物-疾病靶点相互作用网络构建

将上述筛选出的大柴胡汤和2型糖尿病的共同作用靶点利用STRING（Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis，www.string-db.org），构建蛋白质相互作用网络（PPI网络）。使用Cytoscape软件[21]中的cytoHubba 插件[22]按照拓扑学规则计算关键节点，按照节点度Degree 排序得出PPI 网络中排名前10的关键节点。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

使用Cytoscape软件中的CluGO[23]工具对上述得出的大柴胡汤和2 型糖尿病的靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析是一种广泛使用的基因功能注释系统，而KEGG（京都基因与基因组百科全书）是基于基因组测序和大分子数据集生成的高通量技术数据库资源。通过富集分析，可以找到大柴胡汤治疗2型糖尿病的主要潜在生物学过程及作用信号通路。

2 结果

2.1 大柴胡汤治疗糖尿病作用靶点

通过在数据库上搜索结果显示，发现大柴胡汤中8味药物的全部潜在靶点有476 个，检索到2型糖尿病的潜在靶点共有229 个。将大柴胡汤靶点和2 型糖尿病靶点取交集，发现存在41 个共同作用靶点，即INPPL1、PAM、HMOX1、HNF1A、NOS2、INS、PTPN1、PPARA、CYP1A2、PRKCB等等（图1）。

2.2 蛋白质互作网络构建和关键靶点筛选

通过STRING 对41 个大柴胡汤和2 型糖尿病的共同靶点进行蛋白质相互作用网络分析，PPI 富集P值小于1.0e-16，结果差异具有统计学意义（图2）。此PPI 共产生了41 个靶点和270 条边，平均节点度（average node degree）为13.2，平均聚类系数为0.696，PPI 网络富集的P＜1.0e - 16，既具有显著统计学意义。STING数据库可以揭示蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系，圆形节点表示每个已知的由基因编码的蛋白质，节点之间的边表示两者的关系。边的不同颜色代表相互作用的证据类型，如来自实验的证据或者文献证据，边的颜色越多说明获得支持的证据越多。用degree（度中心性）表示某个节点与该网络中其他节点的连接数，degree 越高说明该节点与其他靶点之间的相互作用越广泛。对构建出的互作网络使用Cytoscape 软件中的cytoHubba 进行分析，按节点度Degree 进行排序发现排名前10 个关键节点为INS（胰岛素）、TNF（肿瘤坏死因子）、CAT（过氧化氢酶）、PPARG（过氧化物酶体增殖物激活受体r）、CASP3（caspase-3）、ADIPOQ（脂联素）、NOS3（一氧化氮合酶3），HMOX1(血红素加氧酶 1)、UCP2（解偶联蛋白酶2）、GCG（胰高血糖素），节点颜色越深表明排名越靠前，节点越大表明节点度越高（图3）。

2.3 药物-疾病作用靶点GO功能分析

使用CluGO工具对此41个靶点进行GO生物过程功能富集分析，为了得到更精确的结果，设置Kappa Score 为0.4，选择设置P值小于0.01，合并相似的GO术语，最终共获得79 个生物过程功能富集，并按照Kappa 值分为了12 类（表1）。涉及的生物过程包括：小分子代谢过程的正调控、凋亡信号通路的负调控、对维生素的反应、对糖皮质激素的反应、对生物碱的反应、细胞排毒、对尼古丁的反应、葡萄糖跨膜转运、死亡域受体的信号通路、外在凋亡的负调控、调节胰岛素分泌、葡萄糖稳态、胰岛素受体信号通路的调节。其中涉及到多个与糖尿病相关的生物学过程。

图1 大柴胡汤-2型糖尿病的共同作用靶点预测

图2 大柴胡汤-2型糖尿病共同作用靶点的PPI网络构建

图3 PPI网络中前10个关键节点

2.4 药物-疾病作用靶点KEGG通路富集分析

运用CluGO 工具对41 个作用靶点进行KEGG 信号通路富集分析，设置Kappa 值为0.4，设置P值小于0.01，共获得个41条信号通路的富集结果，按照Kappa值划分为了7类（图7）。这些信号通路主要涉及了：胰岛素抵抗、长寿调节途径、青少年的成年人型糖尿病、碳水化合物的消化吸收、2型糖尿病、胰岛素信号通路和PPAR 信号通路（表2）。可知其中包含了多个与2型糖尿病的相关信号通路。除了7条主要的信号通路外，其他还参与了胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路、AMPK 信号通路、NF-κB 信号通路、鞘脂信号通路、p53 信号通路、细胞凋亡、RIG-I 样受体信号通路、IL-17 信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路等（图6）。

2.5 大柴胡汤治疗2型糖尿病的活性化学成分筛选

通过在TCM-BATMAN[24]数据库中检索大柴胡汤中的药物共得到活性成分474 个，其中柴胡有82 个化学成分，黄芩有65 个化学成分，白芍有35 个化学成分，半夏有31 个化学成分，大黄有58 个化学成分，大枣有49 个化学成分，生姜有133 个，枳实有21 个。胰岛素抵抗（Insulin resistance）、2 型糖尿病（Type 2 diabetes）、胰岛素信号通路（Insulin signaling pathway）是3 条大柴胡汤治疗糖尿病主要参与的信号通路（表2），进而绘制出这3 条主要信号通路上的靶点（图9）。这些靶点在大柴胡汤中所对应的各活性化学成分（图10）和大柴胡汤8 味草药中与参与上述3 条信号通路所对应的主要活性化学成分（图8、表3）。

3 讨论

图4 大柴胡汤-2型糖尿病作用靶点GO生物过程富集分析

图5 GO生物过程富集分析各部分所占比例

糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌疾病，主要由胰岛素分泌缺乏引起。胰岛素是一种重要的内分泌激素，胰岛素分泌以及胰岛功能失常还有可能伴随或引起其他内分泌激素分泌的失调[25]。本研究通过SymMap 和CTD 疾病数据库筛选出大柴胡汤中存在多个对2 型糖尿病直接作用的靶标，并且从PPI 网络计算得知，节点度最高的是编码胰岛素的靶点INS（胰岛素）；在GO 功能分析中，也显示大柴胡汤参与了葡萄糖跨膜转运、调节胰岛素分泌、葡萄糖稳态、胰岛素受体信号通路的调节等生物过程；通过KEGG富集分析，可以看出大柴胡汤的作用靶点直接参与调控了胰岛素抵抗、2 型糖尿病、胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等与2型糖尿病的发病机制直接密切相关的信号通路。说明了大柴胡汤治疗糖尿病的分子生物学机制可能是直接参与了对胰岛素的分泌调控，从而调节血糖。有临床研究显示，大柴胡汤能明显降低2 型糖尿病患者的血糖[26]，改善ß细胞功能，减轻胰岛素抵抗[27]，增加对血糖稳态的调控[28]。从图8 中可以发现，大柴胡汤治疗2型糖尿病的活性化学成分主要集中在柴胡、半夏、生姜、白芍和大黄五味草药中。从图9中可以看出，在3 条主要的通路上又以在胰岛素抵抗（Insulin resistance）这条通路上富集的靶点最多。从图10的大柴胡汤成分靶点网络中可以得出，与INS、TNF 和PRKCB 3 个靶点相关联的大柴胡汤中的化学成分最多。

图6 大柴胡汤-2型糖尿病作用靶点PPI网络KEGG信号通路富集分析

图7 大柴胡汤-2型糖尿病作用靶点网络的主要信号通路各部分比例

表2 大柴胡汤对2型糖尿病治疗靶点KEGG信号通路富集分析

图8 大柴胡汤治疗2型糖尿病草药-成分-靶点网络（1）

大柴胡汤君药为柴胡，《神农本草经》记载“柴胡，主心腹，去肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新”，柴胡的功效与大柴胡汤的功效基本一致。大柴胡汤主治病邪在少阳不解兼入阳明，化燥成实而出现呕不止、心下急、郁郁微烦等症，既能够清解郁热，又能下阳明里实，为表里双解之剂；糖尿病在中医学被称为“消渴”，多认为是由于饮食不节和情志失调导致，治疗常以滋阴清热为主，大柴胡汤能疏转少阳枢机，开达少阳之郁，故能显效。有中医学者认为，现代医学定义的糖尿病不能与我国古代的“消渴”证完全对应，不是所有的糖尿病患者都会出现“消渴”的三多症，而应该针对具体病症具体分析[29]，现代人多嗜食肥甘厚腻，如临床上糖尿病患者常伴有高血脂和肥胖，中医辨证多为气滞痰浊血瘀体质，有的患者还会伴有易怒急躁或抑郁等情志异常表现，这些基本病机形成了糖尿病发病的土壤。大柴胡汤能疏畅三焦气机，化浊通腑，有专家用大柴胡汤来治疗包括糖尿病、肥胖、高血压、高血脂等多种代谢性疾病[30]。这些疾病都存在气滞和膏浊内蕴的相似病机，中医的病机理论和中医所认为的疾病背后的本质可能和现代分子生物学机制存在一定联系[31]，正如本文通过分析大柴胡汤治疗糖尿病的通路机制，发现其能直接参与调控胰岛素的分泌及其相关的多条信号通路。通过上述预测筛选出的靶点和通路机制很可能是在大柴胡汤治疗糖尿病发挥疗效的过程中起着非常重要的作用。

表3 大柴胡汤治疗2型糖尿病主要活性化学成分

本研究基于网络药理学的方法，对大柴胡汤治疗2 型糖尿病的作用靶点和通路进行了预测筛选和分析，与以往的研究结果相互印证，为进一步的实验研究提供了参考方向和理论基础。初步揭示了大柴胡汤作用于2 型糖尿病的多靶点、多机制的复杂网络机制。但由于网络药理学和互联网数据库的局限性，还不能完全表达中医复方有效成分相关作用机制，结合网络药理学的分析结果仍需后续体内体外实验的观察与验证。

图9 大柴胡汤治疗2型糖尿病草药-成分-靶点网络（2）

图10 大柴胡汤治疗2型糖尿病草药-成分-靶点网络（3）