太子参抗心肌缺血作用机制的网络药理学研究＊

高 源，彭丹冰，方 灿，范东生

（1. 贵州省食品检验检测所 贵阳 550004；2. 贵阳中医药大学第一附属医院 贵阳 550001）

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心肌缺血引发的心肌梗死是患者死亡的重要原因。心肌缺血可致氧自由基大量增加，氧化应激又可进一步加重心肌缺血性损伤；而心肌梗死后的心室重塑及纤维化更是导致心功能下降的主要病理基础。因此，寻找安全有效的防治心肌缺血损伤药物具有重要意义[1]。

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根；甘、微苦，平；归脾、肺经；益气健脾，生津润肺。用于脾虚体倦，食欲不振，病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳[2]。太子参始载于《本草从新》，又名孩儿参、童参、双批七、四叶参、米参，是传统中成药复方太子参口服液等品种主要原料；广泛用于太子参黄精胶囊等各类保健食品方面。现代研究表明，太子参主要含有多糖类、皂苷类、环肽类、挥发油类等化学成分，文献报道可知，这些成分具有：抗心肌缺血、提高免疫功能、抗氧化、抗癌、降血糖降脂等药理作用[3-9]。

近年来，有关太子参抗心肌缺血的研究报道较多，如刘湘湘等，利用心肌缺血大鼠模型，以太子参多糖为给药组，硝酸异山梨酯片作为对照组进行试验，发现太子参对心肌缺血大鼠模型有保护作用；孙弼等，利用缺血再灌注损伤模型大鼠，显示太子参多糖能显著减轻心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的心肌组织损伤，并抑制心肌细胞凋亡；吴灵群等通过大鼠心肌缺血模型，以太子参水提物进行灌胃，显示其具有修复心梗大鼠促进缺血心肌组织的功效，通过研究太子参水提物对COCl2 诱导缺氧EA.hy926 细胞的修复作用，提示太子参水提物针对EA.hy926细胞损伤具有细胞增殖、迁移及小管形成作用[10-12]。

太子参在中医临床中多采用复方形式进行治疗，如陈东等通过定心汤加太子参、合欢皮针对气血两虚型心脏神经症进行临床观察，总有效率为77.5%，显效人数为10人，占25%，采用定心汤合太子参、合欢皮治疗心脏神经症，可以有效地缓解患者心悸、胸痛、气短、乏力等症状的发作程度，发作频率及持续时间，提高患者的生活质量。在曹玉山教授辩治冠心病的临床经验一文中，作者采用自拟通冠汤为基础方，采用黄芪、当归、太子参等8 味药材用于临床治疗冠心病，取得很好的疗效，并且文中也提到，曹玉山教授在临床中遇到气血两虚的冠心病患者，也会用太子参代替党参使用，可见太子参在临床治疗中确有疗效[13,14]。

虽然目前已有众多学者针对太子参抗心肌缺血进行了全面研究，但从细胞及分子水平进行系统全面的揭示太子参是通过何种途径发挥抗心肌缺血的作用机制鲜见报道，亟待进一步加强。传统中医药研究，往往缺乏分子药理表征，难以与现代科学有机的融合[15]；而网络药理学在系统药理学基础上建立，利用生物医药领域数据的迅速增加与计算能力与实验手段的快速进步，通过观察药物的整体性、系统性、与中医药传统理论的特点不谋而合，为中医药复杂系统的研究提供了新的视角和思路[16-18]。因此，本研究利用网络生物信息数据库，初步预测太子参活性成分抗心肌缺血的作用靶点及信号通路，为揭示太子参抗心肌缺血的作用机制和太子参的深入研究及开发利用提供参考依据，技术路线见图1。

1 方法

图1 太子参抗心肌缺血作用机制的网络药理学技术路线图

1.1 化学成分的建立

中医药综合数据库（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID）和中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索太子参的化学成分。

TCMID 数据库收集了约 47000 个处方，8159 个中药以及它们包含的25210 个主要成分，并且通过主要成分将它们与3791 个疾病，6828 个药物和17521 个疾病相关的蛋白质关联起来。其中中药相关的数据以及中药与西药关联的数据主要来源于现存的数据库，以及通过人工文本挖掘的方法从发表的文章及书籍中获得；西药相关数据主要来在PubMed、OMIM、DrugBank、Uniprot等数据库。

TCMSP 包括中国药典注册的499 种中药，含29384 种成分，3311 个靶标和837 个相关疾病。该数据库采用的是HIT 数据库预测算法SysDT 来获得药物靶点之间的关系。该数据库中的疾病信息来自TTD数据库和PharmGKB 数据库。这些信息可以在该数据库中查询和下载。该数据库特别的价值在于，它为每种化合物提供了药物药代动力学信息，如成药相似性（drug-likeness，DL）、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）、肠上皮通透性（Caco-2）、脂水分配系数（ALogP）和 H 键供体/受体（Hdon/Hacc）的数量。因此，通过这2 个数据库，用户可以较为全面，准确的搜索药物化合物和作用靶点用于进一步研究。

1.2 活性成分的筛选

将太子参查询所得的化学成分，根据药物动力学（ADME）参数（OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18）设置，进行活性化合物筛选。再通过PubChem 数据库，查找活性化学成分的结构式。

1.3 药物靶点与疾病靶点的建立

通过TCMSP 数据库和SwissTargetPrediction 数据库，查找太子参活性成分作用靶点，建立靶点数据集。通过人类基因和基因表型综合数据库（OMIM）、DrugBank 数据库和TTD 数据库查找对心肌缺血有治疗预防作用的相关基因和蛋白靶点，建立抗心肌缺血的靶点数据集。

1.4 网络构建与分析

通过蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络分析，将太子参活性成分与心肌缺血相关联的靶点蛋白，通过Cytoscape 3.6.1 软件构建可视化的“活性成分-作用靶点-疾病”网络，并得到每个节点的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality 三个拓扑参数，选择以上3 个拓扑参数值均大于所有点中位数值的靶点，作为太子参抗心肌缺血的潜在作用靶点。

1.5 生物过程分析

将筛选出的关键靶点使用生物学信息注释数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）数据库进行KEGG 通路分析和GO生物学过程分析。然后再利用STRING 对筛选出的潜在靶点进行蛋白互作关系分析。

1.6 构建太子参心肌缺血作用的通路图

利用KEGG 信号通路数据库，将与心肌缺血最为密切的靶点在信号通路上标注出来，验证太子参抗心肌缺血作用的主要信号通路。

2 结果

2.1 活性成分的筛选

通过TCMSP 数据库和TCMID 数据库，共查找得到太子参25 个化学成分，以ADME 参数（OB ≥30%和DL ≥0.18）为标准，共筛选得到8个活性化合物及结构式，包括Supraene（角鲨烯）、Acacetin（刺槐素）、Linarin（蒙花苷）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）、Luteolin（木犀草素）、Taraxerol（蒲公英赛醇）、Schottenol（仙人掌甾醇）、1-Monolinolein（1-亚油酸甘油单酯），具体结果见表1。

2.2 药物靶点和疾病靶点数据的筛选

通过TCMSP 数据库和SwissTargetPrediction 数据库，剔除重复靶点后，共筛选得到858个太子参活性化学成分的作用靶点，结果见表1。通过疾病靶点数据库，查找得到418 个心肌缺血相关的靶点。通过PPI网络分析，将靶点导入数据库，筛选出54个交互蛋白，构建蛋白互作网络，可直观的看出活性化学成分与疾病靶点之间的网络关系，结果见图2。其中，黄色方形与黄色圆点分别代表最重要的靶点蛋白和作用靶点；红色三角形代表活性化学成分；蓝色圆点为活性化学成分的作用靶点；紫色圆点代表连接活性化学成分与疾病靶点的交互蛋白。

2.3 太子参抗心肌缺血作用的靶点拓扑参数分析

将太子参活性成分与心肌缺血相关联的靶点蛋白，通过Cytoscape 3.6.1 构建活性成分-作用靶点网络，并对这些靶点蛋白进行拓扑参数计算。得到中位数均值为 Degree：4.0、Betweenness centrality：0.002 6、Closeness centrality：0.241 6。根据中位数值，筛选出12 个靶点，结果见表2。将12 个潜在靶点蛋白进行蛋白互作关系分析，结果见图3。蛋白互作关系分析说明太子参抗心肌缺血的潜在靶点蛋白相互关联且彼此调节。

2.4 GO生物学功能分析

将太子参心肌缺血疾病与活性成分匹配得到的12 个潜在靶点，映射到 DAVID 数据库中，利用 GO 生物学功能富集分析，太子参抗心肌缺血所涉及的生物过程共富集得到116 条，其中P≤0.001 的生物过程共有25条，结果见表3。结果表明，太子参抗心肌缺血与多个生物过程的调控相关，其中最为密切的生物过程包括内皮细胞增殖的正调节、细胞对缺氧的反应、细胞对血管内皮生长因子刺激的反应、一氧化氮生物合成过程的积极调节、肽基丝氨酸磷酸化的正调节、血管内皮生长因子受体信号通路的正调节、血管生成的积极调节、血管生成、血管内皮生长因子受体信号通路等。说明太子参抗心肌缺血可能主要是通过调节血管内皮生长因子而发挥治疗作用。

2.5 KEGG通路分析

将太子参心肌缺血疾病与活性成分匹配得到的12 个潜在靶点，映射到DAVID 数据库中，通过KEGG通路富集得到34 条信号通路，其中22 条信号通路（P≤0.01），结果见表4；其中与太子参抗心肌缺血作用机制密切相关的主要信号通路包括HIF-1 信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡、甲状腺激素信号通路、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic laternal sclerosis，ALS）、mTOR 信号通路、Rap1 信号通路、VEGF 信号通路等。同时利用KEGG 信号通路数据库中的KEGG Mapper 功能将12 个潜在靶点蛋白，在PI3K-Akt 信号通路上标注出来，结果显示有7 个靶点蛋白参与PI3K-Akt信号通路的相关调控，结果见图4。

表1 太子参活性化合物及靶标数

3 讨论

太子参在我国具有悠久的历史，同时也具有丰富的资源。目前，太子参被广泛应用于保健食品和药品等方面；但由于太子参所含的化学成分的非常复杂，难以系统全面的揭示其药效物质基础和作用机制，不利于太子参进一步研究。通过网络药理学方法进行分析，构建“成分-靶点-疾病”关系，为中药药效物质基础和作用机制的研究提供了新的思路和方法，进一步推动了中医药的快速发展。

图2 太子参抗心肌缺血的“成分-靶点-疾病”交互网络

表2 太子参活性成分抗心肌缺血的潜在靶点相关拓扑参数

图3 太子参抗心肌缺血作用的靶点蛋白互作关系图

表3 太子参抗心肌缺血的GO生物学功能富集分析结果

表4 太子参抗心肌缺血的KEGG通路富集分析结果

图4 太子参活性成分潜在靶点在PI3K-Akt信号通路上的标注图

本研究通过网络药理学方法，利用TCMSP、TCMID、TCMIP、BATMAN-TCM 数据库，筛选得到了8个太子参活性化学成分以及与太子参抗心肌缺血直接相关的12 个潜在作用靶点，根据文献报道，戴宇翔等通过临床收集冠状动脉完全闭塞病变患者，观察VEGFA、HIF-1α对心肌缺血影响，结果表明，慢性持续缺血、缺氧所导致的HIF-1α和VEGF 表达增加在促进冠状动脉侧枝循环的建立、增加心肌血供给、改善预后、减少临床心功能不全的发生率方面具有重要意义，张宏如等学者通过电针干预心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织，发现电针干预对心肌保护效应，是通过提高Bcl-2 表达、降低Beclin1 表达以抑制再灌注期的过度自噬而实现的。丛滨海在博士论文中发现雌激素对SGK 表达的调节，并探讨了雌激素、UCNs-CRHR2、SGK 之间的关系，发现雌激素可以通过UCNs-CRHR2系统间接上调心肌细胞SGK 表达，这可能是雌激素在心肌缺血时增强心肌对缺血损伤抵抗力的一种重要分子机制[19-21]。利用GO 生物富集和KEGG 通路注释分析功能，发现34 条信号通路及116个生物过程参与太子参的抗心肌缺血作用，其中与太子参抗心肌缺血作用机制密切相关的主要信号通路包括HIF-1 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡、甲状腺激素信号通路、ALS、mTOR信号通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路。韦皓等[22,23]学者通过研究HIF-1α抗心肌缺血作用机制，可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症因子的释放，降低机体炎症因子水平，改善MIRI心肌损伤，叶桢干等学者[24-26]运用PI3K-Akt信号通路，研究不同药物抗心肌缺血再灌注损伤机制。获得较好的实验结果。刁思帏[27]等通过研究三氟淫羊藿素（ICTF）对大鼠心肌缺血再灌注损伤的治疗作用，发现其机制可能与调控mTOR信号通路抑制细胞过度自噬有关。本文首次运用网络药理学挖掘和筛选，太子参的活性成分，并对其作用靶点与机制进行初步的筛选与分析，以期为太子参的保健食用价值提供科学依据，也为太子参的深入研究及开发利用提供参考。