霸王根际解磷细菌的分离与鉴定

孟建宇 乔宇磊 李蘅

摘 要：以内蒙古西鄂尔多斯荒漠灌木霸王为材料，采用传统分离培养技术，使用无机磷培养基对霸王根际解磷菌进行分离，基于16S rRNA基因序列分析进行分类鉴定。结果表明：从霸王根际土壤中分离纯化得到36株解磷细菌，分别属于γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）以及α-变形菌纲（β-Proteobacteria）。第一优势菌纲为放线菌纲（Actinobacteria），占比为44.45%;分别属于15个属，其中节杆菌属（16.7%）、苍白杆菌属（13.9%）、芽孢杆菌属（11.1%）为优势菌属。

关键词：霸王;根际;解磷菌;16S rRNA

中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）24-0060-04

Isolation and Identification of Phosphorus-solubilizing Bacteria from Rhizosphere of Zygophyllum xanthonylon

MENG Jianyu et al.

（Applied and Environmental Microbiology Laboratory of Life Sciences College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010011，China）

Abstract：Traditional isolation and culture technology and inorganic phosphorus media were used to isolate phosphate-solubilizing bacteria from the rhizosphere of Zygophyllum xanthonylon，which is a desert shrub in the Western Ordos of Inner Mongolia. A preliminary identification was based on the 16S rRNA gene. The results showed that a total of 36 phosphate-solubilizing bacteria were isolated，which belonged to γ-Proteobacteria，Bacilli，Actinobacteria，and α-Proteobacteria，respectively. The first dominant class was Actinobacteria with ratio of 44.45%. The isolates belonged to 15 genera，and Arthrobacter（16.7%），Ochrobactrum（13.9%）and Bacillus（11.1%）are the dominant genera.

Key words：Zygophyllum xanthonylon; Rhizosphere; Phosphate-solubilizing bacteria; 16S rRNA

磷是植物生长发育必需的营养物质之一，是植物体中核酸、蛋白质、ATP的重要组分，参与植物体内多数理化反应过程的调节[1]。土壤中磷素的固定和转化是通过磷素循环实现的，因此，磷素循环的速率决定了土壤中磷的积存[2]。若磷素循环较慢，土壤中有效磷含量下降，植物生长则会受到抑制。如今，绝大多数土壤中磷的含量只有2μmol/L，远低于植物生长的需要（2000μmol/L）[3]。為解决土壤含磷量不足的问题，在实际生产过程中，将大量磷肥施加于土壤，导致大部分磷元素以难溶的无效态在土壤中积累，磷肥中含有较多的有害重金属，过量施加会引起土壤重金属污染，引起食物安全问题，对人类健康造成影响[4，5]。全国农田中的有效磷含量利用率不足20%，导致大量的磷积累在土壤中引起诸多的环境问题，如水体富营养化、赤潮等[6]。

解磷菌（Phosphate-solubilizing bacteria）是土壤中可将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，主要通过分泌各种酶类、有机酸来活化土壤中的难溶态磷，提高土壤有效磷含量，从而促进植物的生长发育[7-9]。此外，其代谢产物可以影响植物根系的分泌，改变植物根际酸化的现状[10]。毕银丽等[11]将植物根际分离得到的解磷菌制成菌肥，施加到荒漠植物的土壤中，土壤有效磷的含量提高，沙土也由酸性土壤变为中性土壤，酸性磷酸酶的活性增强，最终加快植物生长发育。解磷菌分布在植物根系周围的不同位置，表现出明显的根际效应，即根际土中解磷菌的数目比根外土壤中多[12]。Hariprasad等[13]对16株解磷菌进行了番茄接种试验，植株经处理后，根长、株高、鲜重、干重和番茄的磷含量均有不同程度的提高;邢芳芳等[14]筛选了1株具有溶磷作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），盆栽试验表明，经解磷菌处理，白菜的叶绿素、生物产量和叶片数显著地提高，对白菜有明显的促生作用。

霸王[Zygophyllum xanthoxylon（Bunge）Maxim]为蒺藜科，属于强旱生灌木[15]，在我国西北和内蒙古的草原化荒漠地区分布较为广泛。其适应能力强，抗旱、抗寒、耐贫瘠，并且根系繁盛，生长快速，产量高，适合在干旱的砂地和多石地区生长的特性，对于保持土壤稳定，改善环境有非常重要的作用[16]。本研究对霸王根际有解磷能力的细菌进行了初步探索，以期为改良和稳定荒漠地区的生态系统提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 样品为2018年7月采集自内蒙古西鄂尔多斯荒漠灌木霸王根际土，用已灭菌的刷子轻轻将霸王根际土刷至聚乙烯塑料无菌采样袋中，运回实验室。

1.1.2 培养基 1/2 R2A培养基，无机磷细菌培养基（NBRIP）[17]（配制固体培养基加20g琼脂，pH调至7.5左右）。

1.2 试验方法

1.2.1 解磷细菌的分离与纯化 称取植物根际土0.5g，加入49.5mL无菌水，震荡30min，静置10min。吸取1mL上清液，用无菌水稀释成10-1～10-6等6个梯度，各自涂布在固体 NBRIP培养基，每个梯度设3个平行。26℃条件下培养7d，挑取形态各异的单菌落划线纯化，获得单菌落。

1.2.3 菌株的鉴定及其同源性分析 把纯化的单菌落挑入1/2R2A液体培养基，摇床培养浑浊后，吸取菌液加入含30%甘油的1.5mL的无菌保存管中，-80℃保存，同时进行DNA的提取。将提取得到的细菌DNA模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R[18]进行16S rRNA基因的扩增。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检验后送至上海生工进行测序，利用RDP在线程序Classifier及EzTaxon进行同源性分析以确定菌株的种属关系。

2 结果与分析

2.1 分离筛选的解磷菌 利用传统分离培养方法，使用无机磷细菌培养基，对内蒙古西鄂尔多斯荒漠灌木霸王根际的解磷细菌进行分离培养，共筛选得到解磷细菌36株。菌株的菌落多为白色或无色透明，边缘光滑，圆形，表面湿润且黏稠。

2.2 菌株的16S rRNA同源性 分别以36株解磷菌的基因组DNA为模板进行16S rRNA基因擴增，部分电泳检测结果见图1。扩增片段测序后，在EzTaxon数据库中进行同源性分析，结果显示36株菌分属4个纲、15个属，相似度都在99%～100%（见表1、图2）。16株属于放线菌纲（Actinobacteria）类群，其中，GP6、GP7、P2-37-2属于诺卡氏菌属（Nocardioides），GP10、P1-10、P1-58-1、P1-58-2、P1-15、P2-4属于节杆菌属（Arthrobacter），GP12、HP2属于链霉菌属（Streptomyces），GP8、P2-45属于原小单孢菌属（Promicromonospora），P2-31属于红球菌属（Rhodococcus），P2-35-1、P2-37-1属于分支杆菌（Mycobacterium）;8株属于厚壁菌门的芽孢杆菌纲（Bacilli）类群，其中，GP20、P3-13、P1-2属于类芽孢菌属（Paenibacillus），HP4、HP4-1、P3-2、P1-12属于芽孢杆菌属（Bacillus），P2-38属于威廉姆氏菌属（Williamsia）;10株属于变形菌门的α-变形菌纲（α-Proteobacteria）类群，其中，GP16-1、GP16-2、P1-58、P2-6-1、P3-30属于苍白杆菌属（Ochrobactrum），HP1、HP1-1、HP1-4属于甲基杆菌（Methylobacterium），P2-41属于根瘤菌属（Rhizobium），GP9属于叶杆菌属（Phyllobacterium）;2株属于变形菌门的γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）类群，其中，GP22属于泛菌属（Pantoea），P1-13-1属于肠杆菌属（Enterobacter）。其中节杆菌属（6株）占总数的16.7%，为第一优势菌属，苍白杆菌属（5株）占总数的13.9%，为第二优势菌属，芽孢杆菌属（4株）占总数的11.1%，为第三优势菌属。

3 讨论与结论

解磷菌可产生抗真菌的化合物、铁载体、抗生素、氢氰酸和溶菌酶抵抗病原菌，促进植物的生物固氮效率、植物激素的合成和提高Zn、Fe等微量元素的利用，从而促进植物的生长[19]。解磷菌因其具有较强的植物促生效应，对农作物的生长和发育具有显著的协同作用[20]，可被作为生物肥料促进植物的生长[21]。

对霸王根际解磷菌进行研究，筛选出高效解磷细菌，对于调节土壤磷素的供需矛盾，维护干旱荒漠地区生态系统的稳定，改善内蒙古地区的土地荒漠化状态具有重要的意义和应用价值。本研究从荒漠灌木霸王根际分离纯化获得36株解磷细菌，分属15个属，与已报道的文献中解磷菌种属类似[21-23]。其中，诺卡氏菌属（Nocardioides）有3株、原小单孢菌属（Promicromonospora）有2株、叶杆菌属（Phyllobacterium）有1株、节杆菌属（Arthrobacter）有6株、链霉菌属（Streptomyces）有2株、类芽孢菌属（Paenibacillus）有3株、泛菌属（Pantoea）有1株、芽孢杆菌属（Bacillus）有4株、苍白杆菌属（Ochrobactrum）有5株、威廉姆氏菌属（Williamsia）有1株、分支杆菌（Mycobacterium）有2株、甲基杆菌（Methylobacterium）有3株、肠杆菌属（Enterobacter）有1株、红球菌属（Rhodococcus）有1株、根瘤菌属（Rhizobium）有1株。在纲水平上，放线菌纲（Actinobacteria）为第一优势类群（44.45%），α-变形菌纲（α-Proteobacteria）为第二优势类群（27.78%），再次是芽孢杆菌纲（Bacilli）类群（22.22%），与巩瑞红等[23]研究结果一致，与贾丽娟等[21]研究结果有差异。在属水平上，节杆菌属（Arthrobacter）（16.7%）为第一优势菌属，苍白杆菌属（Ochrobactrum）（13.9%）为第二优势菌属，再次为芽孢杆菌属（Bacillus）（11.1%），与很多已报道文献研究有差异[21-25]。解磷菌的分布与空间条件有关[26，27]，其多样性决定于土壤的理化性质，如有机质及磷的含量[28]。在受植物影响、有机质等营养更加丰富的植物如作物等根际微生物中，解磷菌的种类和数量更多样，群落结构更复杂[26]。

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（责编：张宏民）