TQ17对大鼠胚胎-胎仔发育毒性研究

龚夏实，毛闪闪，庞聪，周文，李继洪

(1.武汉大学药学院，武汉 430079； 2.湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司， 武汉 430071)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种全身性自身免疫性疾病，临床上以对称性、破坏性的关节病变为主，患者可表现为晨僵、关节肿胀及功能下降[1]，严重影响人们的健康生活。风湿性关节炎累及人群较广，患有风湿性关节炎等免疫性疾病的孕妇，需用药物缓解疼痛和其他炎症并发症，而具有选择性的环氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制剂在孕期中应用普遍[2]，妊娠期用药需谨慎，从而避免药物对胎儿的不良影响[3]。研究表明：治疗RA的代表药物塞来昔布可引起非洲爪蟾蜍COX-2基因表达增加[4]，因此在孕期使用非甾体抗炎药时，需对此类药物进行孕期风险评估。TQ17是一种新型的非甾体类抗炎药，作用机制是选择性抑制COX-2，从而抑制花生四烯酸，最终生成前列腺素(prostaglandin，PG)，即减少前列腺素。笔者对TQ17的胚胎-胎仔发育毒性进行研究，为临床安全用药提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 10～11周龄无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雌鼠120只，雄鼠90只。动物体质量，雌性215.40～273.49 g，雄性341.86～437.34 g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011 ，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2016-0090。饲料为北京科澳协力饲料有限公司提供的专用鼠颗粒饲料，饮水为高压灭菌水。室温20～26 ℃，相对湿度40%～70%，光照为明12 h，暗12 h。

1.2药品与试剂 TQ17(湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司，批号：170307)；环磷酰胺(山东西亚化学工业有限公司，批号：K94718，含量：97%，实验时用0.9%氯化钠注射液稀释配成所需的受试浓度)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，湖州展望药业有限公司，批号：20160301)；0.9%氯化钠注射液(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，批号：1604250711)；苦味酸(天津市大茂化学试剂厂，批号：20170123)；甲醛(批号：20161011)、冰醋酸(批号：20160728)、氢氧化钾(批号：20150527)、甘油(批号：20161205)、茜素红(批号：20151204)均由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3仪器 电子天平(美国Ohous公司)； LS220A电子天平(普利赛斯公司，感量：0.1 mg)；E200MV生物显微镜(日本NIKON公司)；DQ-8UV超纯水机(Millipore)；数显游标卡尺。

1.4给药剂量设计 参照文献[5-7]，TQ17大鼠药效学有效剂量为6 mg·kg-1·d-1。小剂量组：30 mg·kg-1·d-1，为大鼠药效学有效剂量的5倍；大剂量组：350 mg·kg-1·d-1，约为大鼠药效学有效剂量的58倍。模型对照组：给予同体积0.5%CMC-Na溶液(溶媒)1 mL·(100 g)-1。环磷酰胺组：环磷酰胺15 mg·kg-1·d-1。

1.5实验方法 参照文献[5-8]，SPF级SD大鼠按雌雄1：1和2：1比例合笼，合笼时间为5 d，每日对雌鼠进行阴栓或阴道涂片检查，以查到阴栓或精子日定为妊娠第0天，交配期间每日记录交配情况。90只交配成功的雌鼠按随机分到TQ17大、小剂量组，环磷酰胺组，模型对照组；TQ17大、小剂量组23只，环磷酰胺组、模型对照组各22只。模型对照组和TQ17 小、大剂量组于妊娠第6天至第15天灌胃给药，每日1次；环磷酰胺组于妊娠第12天颈背部皮下注射给药。孕鼠于妊娠第20天解剖。

1.6观察指标 记录黄体数、着床数、吸收胎数、活胎数、死胎数和连胎子宫质量。活胎仔逐一检查外观、性别，称定体质量，并测量顶臀长和尾长。每窝取1/2胎仔放入Bouin氏液固定，作内脏检查，另1/2胎仔固定于体积分数75%乙醇做骨骼畸形检查。

2 结果

2.1TQ17对孕鼠体质量的影响 与模型对照组比较，TQ17大剂量组孕鼠体质量增长显著减慢，妊娠第7天至第15天、第20天显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；环磷酰胺组在大鼠妊娠第13天和第20天显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2TQ17对孕鼠摄食量的影响 与模型对照组比较，TQ大剂量组在妊娠第7天、第14天摄食量极显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3TQ17对孕鼠生殖能力的影响 与模型对照组比较，TQ17大，小剂量组着床数、活胎和死胎差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4TQ17对胚胎形成及外观的影响 与模型对照组比较，TQ17各组对胚胎形成及外观差异无统计学意义(P>0.05)；环磷酰胺组胎鼠平均体质量、身长、尾长和连胎子宫重极显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，胎鼠露脑、肢畸型、趾畸型极显著增加，差异有统计学意义(P<0.01 或P<0.05)，见表4，5。

2.5TQ17对胎鼠内脏的影响 与模型对照组比较，TQ17小、大剂量组胎鼠内脏无显著性影响，环磷酰胺组胎鼠内脏畸形率极显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表6。

2.6TQ17对胎鼠骨骼的影响 与模型对照组比较，环磷酰胺组胎鼠骨骼的畸形或变异显著增加，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；TQ17大剂量致胎鼠胸骨的畸形或变异显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见表7[7]。

3 讨论

COX是花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，有COX-1、COX-2和COX-3三种表现形式，其中COX-2是体内多种细胞响应创伤和炎症而产生的[9-10]。研究表明，在小鼠胃黏膜急性损伤期，COX-2 mRNA及蛋白质水平升高，COX-2 mRNA及蛋白质可修复胃黏膜损伤[11]，COX-2选择性抑制剂对胃肠道可能有一定毒副作用。前列腺素不仅为疼痛递质，还可调节骨细胞功能[10]，即前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)可以刺激成骨细胞和破骨细胞的分化[12]，而COX-2作为PGE2合成的限速酶，通过调节PGE2影响骨生成。COX-2抑制剂亦可引起胎儿宫内发育迟缓，影响骨骼发育[13]。

表1 4组孕鼠不同时间体质量比较

组别大鼠/只第0天第3天第7天第8天第9天第10天模型对照组22247.84±12.82272.85±13.04302.57±14.40308.71±15.33314.88±16.62320.93±15.82环磷酰胺组22248.37±13.32273.16±13.41302.16±15.44306.83±14.31314.40±14.95320.66±14.64TQ17 小剂量组23249.67±17.82274.74±18.08297.43±21.95306.02±19.54310.47±22.22318.84±20.17 大剂量组23249.62±14.75273.66±13.85286.13±13.31①285.36±12.61①287.35±11.48①294.12±12.66①组别第11天第12天第13天第14天第15天第20天模型对照组329.32±16.39335.73±16.71341.65±16.65349.28±15.69357.90±16.00434.38±21.01环磷酰胺组326.57±15.72334.26±14.27328.22±15.41②341.14±13.62348.21±13.52399.16±21.05①TQ17 小剂量组323.71±23.44331.68±20.34335.88±23.76344.40±21.74355.05±23.15437.04±30.94 大剂量组295.63±13.30①297.96±15.07①305.01±16.49①307.94±18.42①312.96±21.42①406.71±24.51①

①与模型对照组比较，P<0.01，②与模型对照组比较，P<0.05。

①Compared with model control group，P<0.01，②compared with model control group，P<0.01.

表2 4组孕鼠不同时间摄食量的比较

组别大鼠/只剂量/(mg ·kg-1)妊娠第0天妊娠第7天妊娠第14天妊娠第20天模型对照组22-8.13±0.669.30±2.787.71±0.576.89±0.86环磷酰胺组22157.70±0.549.60±1.357.90±0.916.82±0.66TQ17 小剂量组23308.23±0.528.09±1.227.88±0.756.37±0.99 大剂量组233508.17±0.61 5.91±2.69① 5.98±1.92①7.91±1.27

①与模型对照组比较，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01.

表3 TQ17 对致畸敏感期孕鼠的影响

组别大鼠/只剂量/(mg ·kg-1)着床数活胎数死胎数模型对照组22-15.32±2.0114.95±2.170.05±0.21环磷酰胺组221516.50±1.7115.55±2.320.32±0.65TQ17 小剂量组233015.48±3.2515.13±3.510.00±0.00 大剂量组2335015.39±2.0214.83±2.610.00±0.00

表4 TQ17对胚胎形成的影响

组别孕鼠/只剂量/(mg ·kg-1)子宫连胎质量/g吸收胎数 黄体数个模型对照组22-85.72±11.640.32±0.5720.41±2.61环磷酰胺组221557.59±12.89①0.64±1.2619.45±2.39TQ17 小剂量组233088.89±20.640.35±0.7119.91±3.74 大剂量组2335087.11±14.160.57±1.3121.09±3.63

①与模型对照组比较，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01.

表5 TQ17对致畸敏感期胎仔生长发育及外观影响

组别剂量/(mg ·kg-1)大鼠/只性别比(雄/雌)胎鼠身长胎鼠尾长cm胎鼠体质量/g模型对照组-220.93±0.513.81±0.191.37±0.103.84±0.36环磷酰胺组15221.21±0.692.85±0.40①1.17±0.17①2.29±0.51①TQ17 小剂量组30230.78±0.433.79±0.221.37±0.173.89±0.32 大剂量组350230.90±0.553.83±0.181.38±0.093.87±0.37组别皮下出血露脑肢畸型趾畸型只模型对照组2.23±3.150.00±0.000.00±0.000.00±0.00环磷酰胺组2.09±3.662.59±4.94①4.23±5.82②7.32±6.03②TQ17 小剂量组1.57±1.670.00±0.000.00±0.000.00±0.00 大剂量组1.83±1.800.00±0.000.00±0.000.00±0.00

①与模型对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.05。

①Compared with model control group，P<0.01；②Compared with model control group，P<0.05.

表6 TQ17对胎鼠内脏的影响

①当1只胎仔出现两种畸形时畸形数仅计算1次；②与模型对照组比较，P<0.01。

①the deformity is counted as one when two deformities exist in a foetus；②Compared with model control group，P<0.01.

表7 TQ17对胎鼠骨骼发育的影响

①与模型对照组比较，P<0.01；②当1只胎仔出现两种畸形时畸形数仅计算1次。

①Compared with model control group，P<0.01；②the deformity is counted as one when two deformities exist in a foetus.

TQ17为治疗RA的非甾体抗炎药，选择性抑制COX-2，可能对胃肠道产生影响，致使大剂量组孕鼠体质量增长缓慢。本实验特设环磷酰胺为环磷酰胺组，环磷酰胺组对胎儿宫内骨骼发育产生明显毒性反应[14]。实验结果表明，环磷酰胺对胚胎形成有极显著阻碍作用，胎鼠外观畸形极显著增加，胎鼠内脏和骨骼的畸形或变异显著增加；TQ17小剂量对胚胎形成、胎鼠外观形态、内脏发育和骨骼发育均无明显影响；大剂量对胎鼠胸骨的畸形或变异较模型对照组相比有显著性升高，但对胚胎形成、胎鼠外观形态、内脏发育均无明显影响，可能对胸骨发育有影响。在实试验条件下，TQ17 30 mg· kg-1·d-1对母体一般状况和子代发育没有影响，350 mg· kg-1·d-1对胎鼠胸骨发育有毒性作用，TQ17有致畸风险。