亮菌甲素原辅料及其注射剂细胞毒性研究*

汪玉馨，唐婉，刘洋，孟长虹，陆益红，，史清水，王广基

(1.中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京 210009；2.江苏省食品药品监督检验研究院药理毒理研究中心，南京 210019；3.徐州医科大学新药研究与临床药学重点实验室，徐州 221004)

亮菌甲素又称假蜜环菌甲素(armillarisin A)，为一种香豆素类化合物，是从我国拥有自主知识产权的环菌属假蜜环菌中培养分离出的活性成分，具有促进胆汁分泌和对胆道末端括约肌的松弛、解痉作用，主要用于治疗急慢性胆囊炎、急性胆源性胰腺炎、黄疸型肝炎、急慢性淤胆型肝炎、肝炎肝硬化重度胆汁淤积症等[1-4]。由于亮菌甲素在水中几乎不溶，常需加聚维酮 K30、丙二醇等辅料提高溶解度以满足临床用药需求[5]，而辅料的安全性问题也越来越受到国内外的关注。除无菌、细菌内毒素不符合要求会导致安全风险外，注射用辅料潜在的过敏性、刺激性、溶血性和基因毒性以及注射用辅料与主药之间的配伍不当均可导致安全性问题的发生[6-8]，因此，对于注射用辅料必须要有严格的安全性与质量要求。

根据前期亮菌甲素原辅料及其注射剂肌肉刺激、血管刺激及溶血安全性评价研究发现，亮菌甲素注射液对肌肉、血管刺激性大于注射用亮菌甲素，且其溶血率也接近标准限度，考虑其剂型不同安全性也存在一定差异，为了对在体试验结果进行验证，笔者比较不同生产企业、不同原辅料之间的细胞毒性是否存在差异，进一步考察亮菌甲素原辅料及其制剂在小鼠成纤维细胞(L929)上的毒性反应，为亮菌甲素注射剂原辅料来源的选择、处方、工艺及剂型优化提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器与试剂 生物安全柜(美国赛默飞世尔科技公司，型号：Thermo 1300series A2)、5%二氧化碳(CO2)箱培养箱(德国Memmert公司)、倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社，型号：OLYMPUS IX53)、光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社，型号：OLYMPUS BX41)、高压蒸汽灭菌器(日本松下电器株式会社，型号：Panasonic MLS-3781L)、细胞计数仪(Countstar BioMed，上海睿钰生物科技有限公司)、培养瓶(美国Costar公司，规格：25 mL)。二甲亚砜(DMSO，美国Solarbio生化试剂公司，批号： 1213C0341)、1640培养基(GIBCO公司，批号：8118167)、小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20170106)、0.25%胰酶消化液(HyClone公司，批号：J180013，)，细胞株[ATCC CCL1 NCTC clone 929(小鼠成纤维细胞)，上海细胞研究所]。

1.1.2实验样品 亮菌甲素注射剂生产企业、规格、批号及其原料来源相关信息见表1，其中注射用亮菌甲素有3家生产企业，3个规格，每个规格2批，共8批；亮菌甲素注射液生产企业仅1家，2个规格，共4批；原料生产企业有3家，由4个制剂生产企业提供，共4批。实验时除原料用DMSO溶解后，用1640培养液(含10%小牛血清)稀释外，其他均直接用1640培养液(含10%小牛血清)稀释。

亮菌甲素注射液各辅料浓度分别为聚维酮K30 0.25%、N，N-二甲基乙酰胺5%、丙二醇30%、聚乙二醇400 1%、聚乙二醇6000 5%、聚山梨酯80 0.5%、硫脲0.06%，同时按上述浓度配制辅料总混液，配制后高压灭菌。

注射用亮菌甲素各辅料浓度分别为甘露醇58.5%、精氨酸39%、枸橼酸钠10%，配制后高压灭菌。

表1 亮菌甲素制剂及原料相关信息

Tab.1 The information of armillarisin A injections as well as its raw materials

剂型与生产企业规格批号备注注射用亮菌甲素 企业A2.5 mgA-1原料来源企业EA-2 企业B5 mgB-1原料来源企业GB-2 企业C5 mgC-1原料来源企业GC-2 企业C1 mgC-3原料来源企业GC-4亮菌甲素注射液 企业D10 mL5 mgD-1原料来源企业GD-2 企业D2 mL1 mgD-3D-4原料 企业EE-1企业A提供 企业FF-1企业F提供 企业GG-1企业B提供 企业GG-2企业G提供

1.2实验方法

1.2.1L929细胞毒性实验 将已培养48～72 h细胞生长旺盛的L929细胞用0.25%胰酶消化液，消化数秒，加入细胞培养液6 mL，用吸管把细胞从瓶壁上吹打下来，混匀后用血细胞计数板在细胞计数仪下计数。根据实测细胞浓度，用适量培养液加入培养瓶，配制成100 000个·mL-1的细胞悬液备用。取12孔细胞培养板，每孔加细胞悬浮液l mL，置37 ℃ ，5%CO2孵箱中培养24 h。

当细胞培养24 h后，弃去原培养液，分别加入用1640培养液配成的供试品液，每孔1 mL。原料阴性对照给予1640培养液(含10%小牛血清)990 μL，加DMSO 10 μL，其他阴性对照给予1640培养液(含10%小牛血清)1 mL。供试品溶液浓度，注射用粉针分别为：0.25，0.125，0.0625，0.031 25 mg·mL-1；注射液分别为：0.05，0.025，0.005，0.002 5 mg·mL-1；原料分别为：1，0.5，0.25，0.125，0.062 5 mg·mL-1；辅料根据其对应的原料浓度稀释计算，注射液对应主药活性药用成分(active pharmaceutical ingredient,API)浓度为0.25，0.05，0.025，0.005，0.002 5 mg·mL-1，注射用粉剂对应主药(API)浓度为0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg·mL-1。

37 ℃、5%CO2孵箱中继续培养72 h，光学倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，弃去原培养液，加入0.25%胰酶消化液，消化数秒后弃去胰酶消化液，再加入细胞培养液1 mL，用吸管把细胞从瓶壁上吹打下来，混匀后在细胞计数仪下计数。

2 结果

2.1亮菌甲素注射剂细胞毒性测定及比较 将亮菌甲素原辅料及其注射剂相应每个浓度的细胞数转换成细胞生长抑制率，用GraphPad Prism 5软件计算出50%细胞生长抑制浓度(IC50)，结果见表2，3。

根据上述实验结果将不同生产企业的注射用亮菌甲素及亮菌甲素注射液L929细胞IC50值进行比较，并按细胞毒性由小至大从左向右排列，结果见图1。

2.2亮菌甲素原辅料细胞毒性测定及比较 将不同生产企业亮菌甲素原料、辅料及辅料总混液各浓度的细胞数转换成细胞生长抑制率，用GraphPad Prism 5软件计算IC50，结果见表4～6。

根据上述实验结果将亮菌甲素注射剂各生产企业的原料及其制剂中的各辅料、辅料总混液按照其相应原料浓度计算的L929细胞IC50值进行比较，并按细胞毒性由小至大从左向右排列，结果见图2。

3 讨论

本实验通过测定亮菌甲素原辅料及其注射剂对L929细胞染毒后的IC50值，比较不同剂型及不同原辅料间细胞毒性大小，由于亮菌甲素不易溶于水，因此用DMSO溶解后，用1640培养液(含10%小牛血清)稀释后给药，其中DMSO在细胞培养液中量不超过1%。同时，由于亮菌甲素原料及制剂均有一定颜色，噻唑蓝(MTT)法测定结果存在一定干扰，故采用细胞计数法对活细胞数进行测定。与MTT法比较，虽然已采用细胞计数仪进行计数，减少人工计数存在的死活细胞辨认等主观误差，但仍然存在操作繁琐、费时费力的局限性，但由于计数过程中可结合细胞形态进行观察，综合判断，结果更为准确[9]。

比较各批次亮菌甲素注射剂IC50值可以发现，亮菌甲素注射液IC50值(0.005 83 ～0.010 25 mg·mL-1)均小于注射用亮菌甲素IC50值(0.060 49～0.175 3 mg·mL-1)，显示注射液的L929细胞毒性明显大于注射用粉针。考察不同生产企业原料的IC50值为0.078 02～0.134 mg·mL-1，与注射用粉针结果相似，故考虑注射液中由于辅料的影响导致细胞毒性增加。

表2 注射用亮菌甲素细胞毒性计数结果

表3 亮菌甲素注射液细胞毒性细胞计数结果

图1 不同批号亮菌甲素注射液IC50值比较

Fig.1 Comparison of IC50value of armillarisin A injections among different batches

与原料及其他辅料相比，注射液中N，N-二甲基乙酰胺(API IC50为0.007 172 mg·mL-1)及丙二醇(API IC50为0.018 53 mg·mL-1)毒性较大，导致辅料总混液(API IC50为0.016 59 mg·mL-1)细胞毒性增加，从而增加注射液的细胞毒性。因此，有必要对亮菌甲素注射液处方和生产工艺进一步优化，降低药用辅料可能带来的不良反应，从而保障人民群众的用药安全。

表4 亮菌甲素原料细胞毒性细胞计数结果

表5 亮菌甲素注射液辅料细胞毒性细胞计数结果

表6 注射用亮菌甲素辅料细胞毒性细胞计数结果

图2 亮菌甲素原辅料IC50值比较

Fig.2 Comparison of IC50value of the raw material and the excipients of armillarisin A