轮状病毒肠炎患儿外周血调节性和辅助性T淋巴细胞以及相关炎症因子的表达水平▲

薛露曦 王甜甜 聂 玲 陈光虎 梅 毅

(湖北省荆州市妇幼保健院儿科，荆州市 434020，电子邮箱：xueluxi1981@163.com)

轮状病毒肠炎又称为小儿秋季腹泻，是儿科的常见病、多发病，多发生于6～24个月的儿童[1]。其主要临床表现为严重的腹泻，病程多为3～5 d，多具有自限性，但是在临床上仍有一部分患儿伴有发热、呼吸急促，甚至出现严重脱水，从而引发心脏、肾脏等多种器官损害，给患儿的生命造成严重威胁[2-3]。T淋巴细胞介导的自身免疫反应在轮状病毒肠炎中有着重要的作用，在不同环境中CD4+T淋巴细胞可分化为不同的T淋巴细胞亚群，其中调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte，Treg)和辅助性T淋巴细胞(T helper lymphocyte，Th)17在轮状病毒肠炎的发病中尤其重要[4]。近年来研究显示，轮状病毒肠炎患儿血清及粪便中的白细胞介素(interleukin，IL)8、IL-6等炎性因子的表达水平明显升高，且与病情严重程度相关[5]。目前，有关轮状病毒肠炎患儿外周血Treg、Th17与炎症因子IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)关系的研究报道较少。本研究分析轮状病毒肠炎患儿外周血Treg、Th17及相关炎性因子水平及临床意义，为今后临床上治疗轮状病毒肠炎提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年3月至2019年3月我院收治的64例轮状病毒肠炎患儿作为研究组，其中男性36例、女性28例，年龄6～24(14.57±3.68)个月，病程0.5～3.0(2.2±1.5)d。纳入标准：符合《实用儿科诊疗规范》[6]中关于小儿轮状病毒肠炎的诊断标准，即年龄6～24个月，病程小于2周，大便次数明显增多(大于10次/d)，大便呈蛋花汤或水样，伴发热、恶心、呕吐等全身症状，粪便经胶体金检测轮状病毒抗原(+)。排除标准：(1)合并严重肝肾功能不全者；(2)重度营养不良者；(3)重度脱水者；(4)药物过敏或依从性差者；(5)其他原因导致腹泻者；(6)临床资料不完善者。另选取60例同期于我院门诊体检的健康儿童作为对照组，其中男性34例、女性26例，年龄6～30(14.3±4.5)个月。两组研究对象一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。两组受试儿童家长均对本次研究知情并签署知情同意书。本研究经荆州市妇幼保健院伦理委员会批准。

1.2 指标检测 所有受试儿童(研究组在治疗前采集标本)均在清晨空腹状态下抽取静脉血4 mL，置入抗凝管内，轻轻摇匀抗凝剂与血液，1 500 r/min离心10 min，取上清液，置于-80℃环境中储存待检。(1)Treg和Th17的检测：取外周血清加入CD4、CD25的抗体(美国BD公司，批号：180127、180205)，用于Treg的标记，将标记后的样本经磷酸缓冲盐溶液洗涤后进行固定破膜；最后加入酶标FoxP3抗体(上海裕平生物科技公司，批号：17123034)进行细胞的标记，避光孵育30 min。采用流式细胞术法分离出外周血清单核细胞，在分离好的单核细胞中加入CD3、CD4的酶标抗体(美国BD公司，批号：180211、180130)，用于Th17的标记；将标记后的外周血单核细胞标本用RPMI-1640培养液洗涤，并加入含胎牛血清的DMEM培养液中，然后放入37℃恒温箱中孵育18～20 h，培养后细胞及对照组避光孵育30 min，然后经磷酸缓冲盐溶液洗涤。最后采用FACSAriaⅡ型流式细胞仪(美国BD公司)测定细胞的荧光强度。(2)炎性因子的检测：采用酶联免疫吸附法检测血清IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素及TGF-β水平，试剂盒购于美国Biotechnology Systems公司(IL-4、IL-6、IL-17，批号：180105、180226)和美国R&D公司(γ干扰素、TGF-β，批号：17120925、17121819)，严格按说明书操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血清Treg和Th17水平比较 研究组血清Treg水平低于对照组，而血清Th17水平高于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组血清Treg和Th17水平比较(x±s，%)

2.2 两组血清炎性因子水平比较 研究组血清IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、TGF-β水平均高于对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 两组血清炎性因子水平比较(x±s,pg/mL)

2.3 轮状病毒肠炎患儿外周血Treg和Th17与相关炎性因子的相关性 轮状病毒肠炎患儿外周血Treg与IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、TGF-β呈负相关(均P<0.05)；Th17与IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、TGF-β呈正相关(均P<0.05)。见表3。

表3 轮状病毒肠炎患儿外周血Treg和Th17与相关炎性因子的相关性

3 讨 论

轮状病毒是一种RNA病毒，是婴幼儿腹泻的主要致病菌之一，引起小儿腹泻的类型主要是A组轮状病毒。轮状病毒肠炎是儿科常见的传染性肠道疾病，多发生在秋冬季节，主要以粪便途径传播，轮状病毒通过感染小肠上皮细胞导致细胞受损，从而引起腹泻[7]。轮状病毒肠炎患儿在发病早期多伴有前驱症状，如发热、恶心等全身症状，在急性期腹泻较严重时可伴有呕吐、腹痛、腹胀等症状。然而该病的发病机制及免疫机制尚不清楚。目前，临床上对该病毒引起的腹泻尚无特异性治疗方法，仍以对症治疗为主。已有的发病机制认为，轮状病毒首先侵犯肠道黏膜上皮，诱导机体发生免疫应答(以肠道黏膜免疫为主)[8]。近年来，国内外针对轮状病毒感染机体细胞免疫应答异常的研究已证实，有许多细胞免疫应答相关因子参与炎症的发生，且与病情有密切的关系[9-11]。

CD4+T淋巴细胞在接受抗原刺激后，可在不同条件下分化为不同的T淋巴细胞亚群，执行不同的生物学功能[12]。CD4+T淋巴细胞在γ干扰素诱导下分化为Th1，分泌γ干扰素以促进炎症反应的发生；在IL-4的诱导下分化为Th2，分泌IL-4以抑制炎症反应应答；在IL-6和TGF-β的诱导下分化为Th17，分泌IL-6、IL-17，参与介导自身免疫性疾病和炎症反应的发生[13-14]。TGF-β是人体内重要的人免疫抑制因子，具有调节免疫、促进黏膜上皮细胞增殖等功能。在本研究中，研究组血清中IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、TGF-β水平均高于对照组(P<0.05)，说明上述炎性因子是轮状病毒肠炎重要的促进因子，在其发病中发挥一定的作用。

Treg和Th17在健康组织中是并存的，在分化过程中有相互调节的作用，在稳定状态下，TGF-β促进Treg细胞的产生，Treg细胞以主动方式调控机体的免疫应答[15-16]。当机体受到病原体侵犯时，内源性IL-6、TGF-β促进Th17的分化。在本研究中，研究组血清Treg水平低于对照组，而Th17水平高于对照组(P<0.05)，这提示Th17/Treg比例失衡时或可导致轮状病毒肠炎的发生。机体免疫系统平衡的维持，常通过CD4+T淋巴细胞亚群相互抑制细胞分化和功能而完成[17-18]。在大多数自身免疫疾病中，过度分化、活化的致病T细胞和调节功能受损，都会打破正常的免疫平衡状态，致使免疫系统向炎症状态发展，最终导致疾病的发生、发展[19-20]。相关分析结果显示，轮状病毒肠炎患儿外周血Treg与IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、TGF-β呈负相关，Th17与IL-4、IL-6、IL-17、γ干扰素、TGF-β呈正相关(P<0.05)，说明轮状病毒肠炎患儿外周血的Treg/Th17失衡比例可能与相关炎性因子水平上调有关，Treg和Th17的分化、活化相互制约，这依赖于各种相关炎性因子的相互作用。

综上所述，轮状病毒肠炎患儿外周血Treg降低而Th17升高，可能与相关炎性因子水平上调有关。Th17/Treg比例失衡时或可导致轮状病毒肠炎的发病，因此，可通过增加Treg细胞数量及加强其功能，同时抑制Th17细胞分化及其功能，以调节两者的比例可能对疾病的恢复有益。