先天性甲低患儿相关基因突变及胰岛素样生长因子结合蛋白表达的研究

(1.北京大学深圳医院检验科,广东 深圳 518000; 2.深圳市妇幼保健院中心实验室,广东 深圳 518000; 3.深圳康宁医院检验科,广东 深圳 518000)

先天性甲状腺功能衰退症是临床最常见的新生儿内分泌疾病之一，会引起自身代谢障碍、生理功能低下及智力障碍等问题[1-3]，其主要发病原因为患儿的甲状腺激素合成减低或发育不全引起[4-5]，碘元素代谢以及甲状腺激素合成与分泌等过程的基因突变与甲状腺激素合成低下具有密切关系。既往有研究表明，双氧化酶2(dualoxidase2，DUOX2)基因突变会导致先天性甲状腺功能衰退症的发生[6-8]。同时，研究表明，胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins-3, IGFBP-3)水平会对生长发育水平产生影响[9-10]，推测甲状腺激素水平与IGFBP-3水平存在某种关联。故本研究选取100例先天性甲状腺功能衰退症患儿的临床资料进行回顾性研究分析，探讨先天性甲状腺功能衰退症患儿相关基因突变以及IGFBP-3蛋白表达水平。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2018年6月100例先天性甲状腺功能衰退症患儿作为研究对象。纳入标准：(1)婴幼儿筛查中促甲状腺激素超过20 μIU/mL；(2)先天性甲状腺功能衰退症患儿诊断标准符合《2014年欧洲儿科内分泌学会先天性甲状腺功能减退症指南介绍》[11]；(3)患儿甲状腺位置正常且肿大；(4)患儿监护人知情并签署知情同意书；排除标准：(1)新生儿未合并其他严重疾病；(2)患儿家属依从性差。选取入组的100例先天性甲状腺功能衰退症患儿作为观察组，年龄范围为2个月至3岁，平均年龄为(1.76±0.55)岁，平均出生体重(3449.00±452.35)g；其中男性21例，女性79例；选取同期67例正常婴幼儿作为对照组，年龄范围为2个月至3岁，平均年龄为(1.69±0.58)岁，平均出生体重(3456.00±452.66)g；其中男性14例，女性53例；比较两组患者平均年龄、平均出生体重以及性别等一般资料差异不具有统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本次研究内容经我院伦理学会批准执行。

1.2 方法

采集婴幼儿外周静脉血5 mL放置于柠檬酸钠抗凝管中，采用贝克曼DNA提取试剂盒进行全血清提取患儿外周血基因，并利用微量紫外分光光度计对提取的患儿DNA进行纯度以及浓度检测，其中OD数值提示为1.79至1.98之间，浓度不低于60.0 ng/μL，浓度最高不超过368.8 ng/μL。根据系统软件设计引物扩增DUOX2外显因子，其合成引物由系统对应公司提供，见表1。其PCR反应体系是由20μLPCR反应缓冲液中含有200 nM dNTPs进行反应，在80 ng DNA模板上，其上、下游引物分为为0.5 μM以及1.25 U Taq聚合酶，其PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55至65 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 7 min，降温至4℃。PCR产物使用同位素标记法对基因进行测序。所有婴幼儿于入院清晨空腹采集静脉血5 mL，经过离心后分离血清测定IGFBP-3，采用DRG International公司免疫放射试剂盒(型号：FREE-001)以及中科中佳科学仪器有限公司的γ免疫计数器(型号：GC-911)进行检查。

表1 DUOX2基因的引物

1.3 统计学方法

所有数据资料均采用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。计量资料数据用的形式表示，行正态性和方差齐性检验后，组间计量资料比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 DOUX2基因外显因子结果

有10例先天性甲状腺功能衰退症患儿存在DUOX2基因第28外显因子发现基因突变，有30例先天性甲状腺功能衰退症患儿存在DUOX2基因第17外显因子发现基因突变，其他先天性甲状腺功能衰退症患儿均未发现相关基因突变。经过生物信息学分析表明，DUOX2第28外显子会导致精氨酸变为组氨酸，见图1；DUOX2第17外显子会导致组氨酸变为精氨酸，见图2。

2.2 两组IGFBP-3水平

与正常对照组相比，观察组患儿IGFBP-3水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05),说明先天性甲状腺功能衰退症患儿存在IGFBP-3水平不足，见表2。

图1 DOUX2第28外显因子部分测序图观察组基因突变测序图，其突变点为A/G杂合双峰；对照组基因测序图为GG符合

图2 DOUX2第17外显因子部分测序图观察组基因突变测序图，其突变点为C/T杂合双峰；对照组基因测序图为GG符合

表2 两组患儿IGFBP-3水平

与对照组相比，aP<0.05

3 讨 论

先天性甲状腺功能衰退症是新生儿最常见的内分泌疾病之一，早期缺乏典型临床症状表现，但如果不能对患儿进行及时诊断以及正确治疗，会对患儿的神经、骨骼等系统的生长发育造成严重影响[12-15]。新生儿先天性甲低经过早期筛查能够及时诊断以及治疗其疾病[16-18]。先天性甲状腺功能衰退症的病因有甲状腺缺乏、发育不良或异位等障碍，然而大多数患儿的发病机制尚不明确。碘元素的氧化以及有机化是甲状腺激素合成的主要缓解以及限速阶段，该过程需要TO以及H2O2的参与。H2O2由DUOX2基因催化形成，若DUOX2在过程中发生突变，造成合成H2O2的功能缺失，进而导致碘元素不能氧化以及有机化，进而导致先天性甲状腺功能衰退症[19]。

随着研究逐渐开展，已发现多种不同类型的DUOX2的基因突变。本次研究中有10例先天性甲状腺功能衰退症患儿存在DUOX2基因第28外显因子发现基因突变以及有30例存在第17外显因子发现基因突变。经过生物信息学分析，DUOX2第17、28外显子发生氨基酸突变，导致患儿蛋白质的改变。但新生儿胎儿期的生长发育与正常胎儿无明显差别，考虑胎儿期来自母体的甲状腺素基本能够保证胎儿的生长发育，羊水中的细胞因子能够有效防止患儿出现甲状腺缺乏引起的严重中枢神经系统损害以及骨骼出现异常，同时能够解释患儿为何在新生儿期尚缺特征性症状。而出生后不久的新生儿IGFBP-3表达水平出现降低。本次研究结果显示，观察组患儿IGFBP-3水平明显低于对照组；提示先天性甲状腺功能衰退症患儿的蛋白水平会受到影响，其主要考虑因素仍是患儿基因突变导致患儿蛋白质空间结构的改变，导致其蛋白质功能不全，故提示DUOX2基因的突变可能引起蛋白质功能的改变进而影响IGFBP-3的合成，传导或者表达导致先天性甲状腺功能衰退症。IGFBP-3水平出现降低可能是患儿出生后出现生长发育迟缓的原因，并且，部分学者研究表明[20-21]，若短期替代治疗，能使IGFBP-3正常，能够保证甲状腺激素能恢复到正常水平，使患儿正常生长。

综上所述，本研究发现先天性甲低患儿IGFBP-3水平降低，并且DUOX2基因会发生突变，结合现有学者研究成果，DUOX2基因突变可认定为导致IGFBP-3水平降低的主要原因，是导致甲状腺激素分泌不足，造成患儿生长发育迟缓，采取相关治疗提高患儿IGFBP-3水平，对患儿进行IGFBP-3水平的早判断以及治疗具有重要临床意义。