不同处理方式对蔬菜种传病毒病的消毒效果评价

周玉忠，王忠全，夏世龙，李彦辉，梁文星

（1.青岛优百粒种子处理设备有限公司，山东莱西 266600；2.青岛农业大学，山东青岛 266000）

种子在经济学和生物学上的意义是显而易见的，这是因为种子常被用作食物的来源并具有其他一些重要用途，如为工业化学品和其他产品的制造提供资源[1]。种子的健康和活力在确保农作物的产量和质量方面起着重要作用。在影响种子健康的各种因素中，病毒病是最大的影响因素之一，不仅会降低产量[2]和发芽率，而且还可以改变种子的形状、颜色及化学组成。种子不能简单地用化学药品处理，种植户也往往不了解有效的处理方法，因此近年来，由种子病毒病导致的作物产量和质量的下降越来越严重[3]。

病毒控制最有效的方法是使用脱毒种子。迄今为止，研究主要集中在通过使用各种化学物质、热疗法、臭氧和存储方式来灭活蔬菜种子中的病毒。Córdoba-Sellés 等[4]研究得出，将种子在10%磷酸三钠中浸泡3 h，可以使黄瓜绿斑驳花叶病毒充分失活。Rast A 等[5]研究发现，种子收获3 个月后，在76 ℃的烤箱中干热处理72 h，可消除整个辣椒花叶病毒种群，但对发芽不利。

目前研究人员已经认识到种子是病毒传播中的主要传染源之一。但尚需进一步根据不同品种种子与其携带的多样性病毒种类来确定消毒处理的最佳药剂、使用剂量和治疗持续时间，同时又不降低种子质量。本试验研究了常见的化学和物理方法在清除番茄中的番茄花叶烟草花叶病毒（ToMV），番茄和辣椒中的烟草花叶病毒（TMV），辣椒、甜瓜和南瓜中黄瓜花叶病毒（CMV）的效率，探索了种子消毒的最佳处理方式。

1 材料和方法

1.1 种子材料来源和病毒检测

215 个样品从不同的种子公司获得，经酶联免疫吸附测定（ELISA）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定，确定了6 种高感病样品被用作试验材料，分别为感染TMV 的番茄种子、感染ToMV 的番茄种子、感染CMV 的辣椒种子和感染TMV 的辣椒种子、感染CMV 的甜瓜种子、感染CMV 的南瓜种子。

1.2 病毒灭活处理

试验设计7 个病毒灭活处理，每个处理每种样品选择300 粒种子、重复3 次。根据ISTA[6]抽样标准，从每种高病毒感染率的种子中选择300×7×3=6 300 粒种子进行病毒灭活处理。病毒灭活处理后，立即进行洗涤、干燥并置于无菌培养皿中，测定相应的指标。

病毒灭活处理如下：（1）臭氧熏蒸处理：10 g/m3臭氧熏蒸10 min；（2）乙酸浸泡：在0.8%的乙酸（CH3COOH）中浸泡20 min；（3）过氧化氢浸泡：浸入4%过氧化氢（H2O2）溶液中浸泡20 min；（4）盐酸浸泡：在2%盐酸（HCl）中浸泡30 min；（5）次氯酸钠浸泡：在0.4%的次氯酸钠（NaClO）中浸泡30 min；（6）干热处理：使用干热处理设备在80 ℃下将种子加热24 h；（7）温汤浸种：将种子浸入65 ℃的热水中浸泡25 min。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 消毒效果

上述处理后用单克隆抗体法[7]对种子进行ELISA 测试，用酶标仪在405 nm 波长下测定吸光度值（OD值），通过标准曲线计算样品中病毒的浓度，以评估种子处理效果。消毒效果计算公式见式（1）。

式中，A-对照种子的吸光度值；B-处理种子的吸光度值。

1.3.2 发芽率

根据ISTA 规则[6]在培养皿中的两层滤纸上进行发芽测试。将种子（每次处理25 个）放在平板中，并在室温（20 ℃）下培养至胚根长到2 mm 长。发芽率计算公式见式（2）。

1.4 统计分析

利用SPSS13 软件中的单方差分析模型对试验数据进行统计分析，用SNK 法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同种子处理方法对种子发芽率的影响

表1 不同种子处理方法对不同作物种子发芽率的影响Table 1 Effects of different seed treatments on seed germination rate

不同种子处理方法对不同作物种子发芽率的影响见表1。经发芽率检测结果显示，不同处理对种子质量无显著影响，种子发芽率均在96%以上。

2.2 不同种子处理方法对种子的消毒效果

不同种子处理方法对作物种子病毒的消毒效果见表2。由表2 可知，7 种供试方法的消毒效果中最高为71.7%，这说明没有一种处理能够完全消除种子中的病毒，且不同处理方法病毒浓度的降低幅度不同。

2.2.1 HCl 处理对种子的消毒效果

HCl 可使病毒蛋白凝固并损害酶系统或改变膜通透性，从而引起寄生在种子种皮或内表皮的病毒死亡。由表2 可知，HCl 处理是最有效的处理方法，导致番茄ToMV、番茄TMV、辣椒CMV、甜瓜CMV、南瓜CMV 发生率分别降低了71.7%、84.7%、62.7%、65.1%、64%。相比于其他处理方法，这种方法对辣椒中的TMV 的消除效果为中等，消除率为17.9%。

2.2.2 臭氧处理对种子的消毒效果

臭氧是一种强氧化剂，可直接与种子携带的病毒发生作用，破坏病毒细胞、核糖核酸（RNA），分解脱氧核糖核酸（DNA）、RNA、蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使病毒的代谢和繁殖过程遭到破坏，从而灭活种传病毒。由表2 可知，臭氧处理的种子根据病毒和种子的不同，病毒浓度降低幅度在0.6%～55.7%之间，变化很大。从对上述几种种传病毒的消毒效果看，臭氧处理对被ToMV 感染的番茄种子最有效。

2.2.3 CH3COOH、H2O2、NaClO 对种子的消毒效果

CH3COOH、H2O2、NaClO 均为强氧化剂，杀菌原理与臭氧相同。CH3COOH 处理对病毒的灭活比率影响很小，对南瓜CMV 病毒消毒效果为4%，对番茄ToMV 消毒效果为8%。用H2O2、NaClO 处理种子，在整个病毒种子组合中获得几乎相同的结果。用H2O2、NaClO 处理感染ToMV 的番茄种子分别减少了42.3%、37.3%。可见，经TMV 感染的番茄种子病毒消毒处理效果在5.8%～9.2%的范围内略有减少，在CMV 感染的辣椒种子消毒处理效果在3.8%～17.5%的范围内略有减少。

2.2.4 干热处理、温汤浸种对种子的消毒效果

干热处理种子是在保障种子活力的条件下，依据不同作物种子的温湿度耐受值，使种子在稳定的高温低湿环境中达到病原菌的致死温湿度，杀灭病原菌。由表2 可知，在整个病毒种子处理组合中，干热处理对辣椒CMV的消毒效果不好，而对其他病毒的消毒效果都较好，且对种子发芽率、发芽势无伤害。在65 ℃的热水中加热25 min 的温汤浸种也显示出良好的消毒效果，除对番茄TMV、辣椒TMV 的消毒效果不佳，对其他病毒的消毒效果都很好。

3 讨论

目前我国农民使用的种子大多是未经认证的种子，很容易在生产阶段引入新的病害。因此，建议使用经过病毒测试的种子来降低种子传播病毒的发生率，并且进行相应的发芽测试。因为即使在相同的蔬菜物种中，种子批次的敏感性也有所不同，目前缺乏针对每种类型的种子或病毒物种的标准处理方法。因此，本试验研究了不同蔬菜种子中的各种病毒，以寻求控制种子病毒传播的最有效、最可靠的方法。

试验结果表明，没有一种处理能够完全消除种子中的病毒病。Agarwal 等[8]认为大多数种子传播的病毒都出现在胚内。Broadbent L[9]在番茄种子的胚珠和胚乳中发现了ToMV。ToMV 主要通过番茄种子的种皮和胚乳传播，不通过胚[10]，但在辣椒种子中则主要通过种皮传播，很少通过胚乳或胚芽[11]。CMV 存在于辣椒、甜瓜和西葫芦种子的胚、胚乳和胚珠中[12]。

物理方法或温汤浸种处理是基于对病原菌的致死温度而杀死种子表面及内部病原微生物的原理来防止感染的，这是降低种子传播病毒水平的最古老的方法之一，在化学品防治未普及时，它确实很流行[13]。在这项研究中，分析了温水（65 ℃下25 min），干热（80 ℃下24 h）的功效。试验发现，相比于其他处理方法，热水和干热处理均能有效地消灭病毒，但是，温汤浸种操作过程中水温不容易控制，很容易造成出芽率降低。

CH3COOH、HCl、NaClO 和H2O2是廉价且环保的化学药品，具有潜在的、广泛的应用范围，尤其是在禁止常规杀虫剂的种子处理或其他消毒处理中，例如有机农业生产中。在我们的实验条件下，除了被TMV 感染的辣椒种子外，在灭活病毒方面，发现HCl 比CH3COOH、NaClO和H2O2更有效，此外，HCl 对发芽没有负面影响。Broadbent[10]也获得了类似的结果。通常，CH3COOH、NaClO和H2O2处理无法有效清除种子中的病毒，这些结果与Anderson[14]获得的结果不一致。

天然存在于地球大气中的臭氧气体被用作消毒剂已有100 多年的历史了，美国环保署报告说，臭氧通过氧化衣壳蛋白来影响病毒。Finch 等[15]证明了含臭氧的水在杀死植物病原性真菌和病毒方面的成功，在这项研究中，对各种持续时间和剂量的臭氧的灭菌效果进行了评估，以揭示其控制种子传播病毒的功效。试验表明用臭氧处理可以有效降低种子中的病毒浓度，尤其是在以5 g/m3的浓度处理1 h 和以10 g/m3的浓度处理10 min 而又不妨碍发芽时，这和Runia[16]的试验结果一致。

Johansen 等[17]提出约18%～20%的植物病毒是种子传播的。病毒感染的种子通常会引起原发性感染，种子流通通过跨区域运输越来越频繁，病害发生风险逐年增高，这可能会导致产量和质量的巨大损失。因此，实现种子健康问题和寻找控制种子病毒传播的方法非常重要。在本试验中，与其他处理相比，用HCl、干热、温汤浸种和臭氧处理对减少蔬菜种子的病毒感染更为有效。H2O2、CH3COOH 似乎无法成功灭活种子中的病毒。然而，HCl（2%持续30 min）、干热（80 ℃持续24 h）和臭氧（10 g/m3持续10 min）对种子的病毒灭活效果好，而不会阻碍种子发芽，但下一步还需研究具体剂量和能持续的时间，否则细微差异也会导致种子损伤或无法消除病毒。