代谢组学在化学品风险评价中的应用

常静，潘一帆，魏若瑾，李济彤，杨璐，朱莉飞，王会利,*

1. 中国科学院生态环境研究中心环境生物技术重点实验室，北京 100085 2. 北京市水产科学研究所，北京 100068

据美国《化学文摘》数据库(Chemical Abstracts Service Registry, CAS Registry)统计，目前市场上使用的化学品约有840万种，仅有24万种已经列入监管名录(https://www.cas.org/about/cas-content)。化学品风险评估对保护人类健康起到重要作用，然而传统化学品毒理学评价速度(平均2～3年/化学品)[1]已经赶不上化学品的发展速度(200～300化学品/年)[2]。目前，约80%以上化学品的环境安全信息是缺失的，这对化学品毒性风险评估工作带来前所未有的挑战[3-4]。传统的毒性测试方法具有通量低、周期长、敏感度低和成本高等特点。近年来，随着毒理学新技术的发展，国内外研究学者已经开始从传统的毒理学试验方法向快速、灵敏和高效的试验方法转变，例如，作为系统生物学的重要组成部分，基因组学、蛋白质组学和代谢组学在化学品毒性作用机制研究中具备很大优势。

基因组学和蛋白质组学应用于毒理学评价并不能直接提供毒性终端信息，而所有生理病理状态的改变都可以通过直接的生物化学反应，从内源代谢物的浓度和种类上体现出来，所以，继基因组学和蛋白质组学之后，代谢组学被纳入新的研究策略[5]。将代谢组学技术应用于毒理学研究的主要原理是通过分析生物化学通路中小分子代谢物(碳水化合物、脂肪酸、核酸和氨基酸等)的变化情况筛选出早期暴露的重要生物标记物，揭示化学品暴露之后的主要干扰通路和毒性机理。虽然，近年来代谢组学已经广泛应用于毒性评价领域，但是尚未见系统地介绍代谢组学在化学品毒理学研究中的优势与应用。鉴于此，本文对此进行综述。

1 代谢组学概述(Overview of metabolomics)

1.1 代谢组学起源

代谢组(metabolome)最初是由Stephen Oliver在1998年提出的，主要指基因缺陷或过表达过程中导致的代谢物的变化情况[6]；1999年，Jeremy Nicholoson提出了代谢组学(metabonomics)的概念，指出代谢组学是通过考察生物体在经过生理、病理刺激或者遗传修饰后，其内源代谢物的动态变化[7]；2001年，Oliver Fiehn对代谢组学(metabolomics)概念进行更新，提出代谢组学主要是对所研究的生物系统的所有代谢产物进行全面定量分析[8]。

1.2 代谢组学的发展

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。代谢组学主要是研究细胞、组织或生物液体中自然发生的低分子量(<1 000)有机代谢物(糖、有机酸、脂质、维生素、氨基酸和芳香烃类化合物等)的科学。代谢组学研究主要分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。非靶向代谢组学是非目标性地对所有可能发生改变的代谢物进行检测，筛选出目标代谢物及相应的代谢通路，而靶向代谢组学是有目标地对特定通路中的代谢物进行检测分析。

代谢物的检测有多种方法，可以选择核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)、气质联用(gas chromatography-mass spectra, GC-MS)和液质联用(liquid chromatography-mass spectra, LC-MS)等分析仪器，各个方法的优缺点如表1所示。其中，NMR具有较高的分辨率，并且对样品的损伤小，检测时间短，但是灵敏度差；GC-MS有完整的数据库支持，灵敏度要比NMR高，但是样品前处理过程繁琐；LC-MS具有较高的分辨率和灵敏度，但是不具备完整的数据库，目前，可供参考的数据库有Human Metabolome Database (HMDB)、Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD)、Metlin、Lipidmaps和Mzcloud等。

代谢组学数据分析常用的方法为主成分分析法(principle component analysis, PCA)、偏最小二乘法-判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS)。根据模式识别结果筛选出显著变化的代谢物，之后利用一些网络工具及公共数据库如MetaboAnalyst、HMDB和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)等进行代谢物的信息解释，利用P值和推测变异重要性值(variable importance in the projection, VIP)寻找受到显著影响的代谢通路，进一步通过代谢通路的变化对致毒机制进行深入探究。

代谢组学标准计划(Metabolomics Standard Initiatives, MSI)于2005年启动，意在对代谢组学方法进行规范和标准化。2007年，连续发表10篇关于代谢组学标准化的相关文章[9-18]，特别是针对将代谢组学应用于毒理学研究过程中的质量保证和质量控制问题展开研究[19]。经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)在2018年开始着手起草代谢组学报告框架(Metabolomics Reporting Framework, MRF)，这一项目的实施也将为代谢组学数据库的建立打下基础。

表1 代谢物检测方法的总结Table 1 The summary of metabolite detection methods

1.3 代谢组学应用范围

不同于基因组学和蛋白组学，代谢组学的研究可以反映某一时刻下正在发生的生命活动情况。研究代谢物的表达量、代谢物与生理病理变化的关系，能够帮助寻找新的生物标记物，发现新的代谢途径。目前，代谢组学可以应用于疾病的早期诊断[26-29]、环境监测与毒性评价[30-32]、转基因和育种[33-35]等多个方面。

代谢组学在毒理学评价中的应用主要分为以下3个方面：第一，作为毒理学研究工具发现化学品毒性作用通路和分子关键事件(key event, KE)，并根据KE对化学品进行分类[36]；第二，在分子水平上提供细胞或者有机体表型的功能，与不良有害结局路径(adverse outcome pathway, AOP)之间的联系[37]；第三，通过分析暴露化学品及其代谢物的浓度来评价化学品的毒性效应[38-39]。

2 代谢组学应用于毒理学评价的优势(The advantages of metabolomics applying in toxicological assessment)

传统评估化合物毒性的方法在很大程度上依赖于动物实验，但是多种动物模型的安全性试验结果用于人类是不可靠的[3]。同时，大量试验动物的使用造成化学品毒性评价的成本过高。例如欧盟化学品的注册、评估、授权和限制(registration, evaluation, authorization and restriction of chemicals, REACH)为了评价68 000种化学品的毒性，在未来10年间将花费95亿欧元和消耗5 400万脊椎动物[2]。而基于代谢组学的毒理学评价方法可以从体外细胞水平或者组织水平来评价化学品的毒性风险，不仅大大减少了试验动物的用量，降低了实验成本，而且增加了评估化学品对人类健康风险的准确性。

传统毒理学基于半数致死剂量(LD50/LC50)、临床检查(血液学检查、血液生化检查)和病理学观察(系统解剖、脏器重量和组织学改变)对化学品毒性进行风险评估，这种表观毒性评价方法不仅试验周期长(几天甚至几年时间)，而且不能从本质上揭示化学品对生命体的毒性作用机制。应用代谢组学进行毒性评价可以直接监控生物对污染物最早期的反应，在几乎一出现毒性反应时就能检测出发生变化的全部代谢物表达情况及受干扰的代谢通路。因此，比起传统的毒理学测试方法，利用新的毒理学方法评估化学品毒性可能会提供一个更早更灵敏的毒性反应的生物标记。

同时，利用代谢组学可以将一类化学品的毒性作用机制进行总结与外推[40]，也可以将化学品对模式生物的毒性外推到非模式生物，比如通过对比小鼠和人类代谢系统的相似度，由此从化学品对小鼠的毒性外推到其对人类的风险[41]。

3 代谢组学在毒理学评价中的应用案例(Application of metabolomics in toxicological assessment)

3.1 生殖毒性的研究

对人类而言，化学品暴露的潜在生殖毒性是公众、卫生专业人员和环境学家都十分关心的问题。考虑到繁殖的重要性，利用代谢组学对化学品的生殖毒性展开研究不仅可能有助于开发新的、更细微和更有洞察力的生物标记，而且还可能为评价化学品生殖毒性开辟新的途径。

根据OECD的测试方法来粗略计算大型溞的后代数量不能表现出化学品对生殖系统的毒性作用机制，所以Taylor等[42-43]利用NMR技术检测了镉、2,4-二硝基苯酚和心得安早期暴露后的差异代谢物，揭示了短期化学品暴露后大型溞体内标志代谢物可以预测化学品长期暴露后的生殖毒性情况和潜在毒性作用机理。Yan等[44]通过性激素分析、性腺轴相关基因分析及代谢组分析(应用NMR和LC-MS技术)，对比了硫丹的2个对映体和其中1个代谢产物(暴露浓度为0.3 mg·kg-1bw·d-1和3 mg·kg-1bw·d-1)对成年小鼠睾丸的毒性差异，研究表明，14 d暴露后血清中性激素水平的变化和睾丸中内源代谢物的变化呈现显著相关性，预示着硫丹对小鼠性腺系统的干扰机制可以通过代谢组学手段进行揭示。

4-溴联苯醚(4-bromophenoxybenzene, BDE-3)是多溴联苯醚在光照下的分解产物，对生殖功能具有一定的影响。Wei等[45]将不同浓度(0.0015、1.5、10和30 mg·kg-1bw·d-1)的BDE-3染毒小鼠42 d，通过精子数量和睾丸损伤情况发现BDE-3对小鼠的生殖系统的功能造成了干扰，进一步通过超高效液相-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)技术对睾丸内代谢物及代谢通路进行分析，通过结果可知，酪氨酸代谢、嘌呤代谢和核黄素代谢通路有望解释BDE-3对小鼠生殖系统的干扰机制。

壬基酚是一种被证实的内分泌干扰物，可以引起生殖和发育毒性。Di等[46]研究了壬基酚低浓度长期暴露(500 μg·kg-1bw·d-1，暴露8周)下对雌性老鼠生殖系统的影响，壬基酚暴露不仅使血清中雌二醇(E2)水平显著变化，子宫内膜增生，卵子发生改变，并且尿液、血液、子宫和卵巢内的代谢谱(采用超高液相-静电场轨道阱质谱(UPLC-Orbitrap-MS)方法)也随之发生了显著变化。其中，与能量代谢相关的12种代谢物，特别是9种肉毒碱，被认为是壬基酚低浓度早期暴露下的敏感生物标志物。

有机磷阻燃剂磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate, TDCIPP)可以对水生生物造成生殖毒性，Zhu等[47]利用转录组学和代谢组学手段探究了TDCIPP对陆生生物蚯蚓的生殖毒性。蚯蚓暴露于不同浓度(50、500和5 000 ng·g-1)TDCIPP污染的土壤28 d，其类固醇合成通路被抑制，同时通路中胆固醇浓度显著上调，表明TDCIPP暴露影响了蚯蚓的生殖系统。

去氢孕酮(dedrogesterone, DDG)暴露可以干扰硬骨鱼类的性别组成，但是其毒性作用机制尚不清楚。Jiang等[48]将不同浓度(4.4、44和440 ng·L-1)的DDG染毒处于性别分化关键期的斑马鱼胚胎140 d，结果发现，高浓度暴露下98%斑马鱼为雄性。基于LC-MS和GC-MS平台对斑马鱼胚胎的代谢谱进行分析，结果显示，多不饱和脂肪酸、肌醇、牛磺酸、棕榈油酸、油酸、乳酸、反丁烯二酸和尿嘧啶的浓度增加，尿酸和胆汁酸的浓度降低。这些代谢物起到抑制斑马鱼性别分化通路的作用，其中，包括NF-κB、COX-2和Wnt/β-catenin通路，同时p53通路被激活。以上结果表明，DDG在环境浓度暴露下就可以干扰斑马鱼胚胎的代谢谱，最终对其性别分化造成影响。

17α-炔雌醇对生物体的生殖系统具有重要影响，Zhou等[49]通过生理性观察和代谢组分析(采用GC-MS方法)研究了其对淡水鱼生殖系统的作用机制，研究结果表明，环境浓度(17.1 μg·L-1)暴露下17α-炔雌醇没有对淡水鱼的生理上(体重、体长、肝指数和性腺指数)产生显著影响，然而性腺中24种代谢物和肾脏中16种代谢物均出现了显著性变化，这些代谢物主要调控着氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢和氧化应激通路，其中，脂质代谢通路的变化影响了淡水鱼体内性激素稳态。以上结果表明，利用代谢组学手段可以从环境浓度揭示化学品对生物体性腺系统的干扰机制。

3.2 肝脏毒性的研究

肝脏作为化学品暴露之后的主要靶向器官，化学品暴露对肝脏的毒性研究较为广泛，然而环境浓度暴露下化学品对肝脏的损伤情况并不显著，需要利用更加灵敏的技术来探究其潜在毒性风险。例如，Wang等[50]通过NMR非靶标代谢物分析和LC-MS靶标代谢物分析发现，苯霜灵(6 mg·kg-1bw·d-1和60 mg·kg-1bw·d-1)经口染毒SD大鼠30 d后，大鼠在没有出现明显肝脏损伤的情况下，其代谢谱发生了显著变化。以上结果表明，应用代谢组学来评价化学品对生命体肝脏的毒性比传统毒理学手段更加灵敏可靠。

有研究指出，短链氯化石蜡暴露后，其可以与大鼠肝脏中的过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)结合，干扰PPARα的信号通路，PPARα主要调控脂肪酸的代谢过程，通过分析脂肪酸的含量(采用液相-四级杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS)方法)发现，短链氯化石蜡暴露(1、10和100 mg·kg-1bw·d-1)28 d使大鼠肝脏中脂肪酸总量显著降低，脂肪酸过氧化加剧，这一研究揭示了短链氯化石蜡对大鼠肝脏的毒性作用靶点[51]。

有研究发现，在大西洋鳕鱼进食含有痕量甲基毒死蜱农药的食物之后，鳕鱼肝脏中可以富集高浓度的甲基毒死蜱，使血浆中胆碱酯酶活性发生显著变化，肝脏中胆固醇和激素合成通路受到显著影响，同时能量代谢通路，包括碳水化合物代谢、三羧酸循环和运输、碳水化合物代谢、丙酮酸代谢和运输途径中的代谢物均发生显著变化，揭示了环境浓度下甲基毒死蜱的肝脏毒性作用机制[52]。

Dong等[53]通过肝脏组织病理学观察发现，低浓度三氯生(0.05 mg·kg-1bw·d-1)的暴露使小鼠肝脏中的脂肪含量显著增加，进一步通过代谢物分析可知，脂肪酸、磷脂和神经酰胺化合物的含量也随之显著上调，揭示了三氯生对小鼠肝脏的毒性。Geng等[54]利用转录组和代谢组联合分析的手段，研究了三氯生对小鼠的肝脏毒性，揭示了三氯生对肝脏的主要作用机制为抑制能量代谢通路和激活PPARα通路。Zhang等[55]进一步研究了三氯生对人类肝脏细胞的毒性作用机制，发现三氯生暴露主要干扰了肝脏细胞的能量代谢通路、抗氧化系统和二相代谢排毒系统。以上研究结果证明了代谢组学手段分析肝脏毒性的准确性和灵敏性。

3.3 肾脏毒性

肾脏毒性常由多种治疗药物和环境污染物暴露引起，但是导致肾脏毒性的复杂分子和病理生理机制仍然不清楚，主要是由于肾脏损伤的生物标志物在敏感性和特异性方面存在不足[56]。近年来，利用代谢组学对化学品的肾脏毒性进行研究的报道越来越多。

在已知烟酸受体-SCH900424可以引起小鼠肾脏损伤的情况下，Zgoda等[57]通过GC-MS、LC-MS分析内源代谢物含量的变化发现，血清和脑中的3-硫酸吲哚是较为灵敏的生物标记物，它可以指示SCH900424引起的肾脏毒性情况。Ranninger等[58]利用人类肾脏近管上皮细胞RPTEC/TERT1进行暴露实验，通过LC-MS分析非靶标代谢物的变化情况，来探究异环磷酰胺代谢物——氯乙醛的肾脏毒性。研究结果表明，氯乙醛高浓度暴露(35 μmol·L-1)下主要干扰了肾脏细胞中谷胱甘肽和氧化应激相关的代谢物，进一步通过转录组和蛋白组验证了代谢组学技术的可靠性。1,4-二氧己烷在环境和生物样品中被广泛检测到，具有潜在的肾脏毒性。Qiu等[59]结合肾脏转录组和尿液代谢组分析揭示了1,4-二氧己烷对大鼠肾脏的毒性作用机理。研究表明，低浓度(0.5 mg·L-1)暴露对肾脏中的信号通路产生显著影响，基于NMR的代谢物分析显示早期暴露主要影响了甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢通路而长期暴露使牛磺酸浓度显著减少。

3.4 神经毒性的研究

通常化学品的神经毒性一般通过受试生物的运动和感觉功能、反应灵敏度、联想学习能力、记忆和认知能力等参数来表征[60]，但是其在分子层面上的毒性作用机理还处于空白阶段。大脑中央神经系统中的神经递质及其代谢物对化学品的神经毒性作用十分敏感[61]，所以，研究化学品暴露后对神经递质及其代谢物的影响将有望揭示其神经毒性作用通路和致毒机理。

丙烯酰胺具有神经毒性，但是其对神经系统的干扰机制尚不清楚。Faria等[62]研究了0.75 mmol·L-1丙烯酰胺暴露3 d后对斑马鱼神经系统的作用机制，在行为水平上，丙烯酰胺暴露后斑马鱼表现出抑郁型与焦虑型并存的行为状态；在转录水平上，丙烯酰胺诱导相关再生基因的下调，少突胶质细胞和反应性星形胶质细胞标记物上调，也改变了参与突触前囊泡周期基因的表达；在代谢水平上，基于液相-三重四级杆质谱(LC-MS-MS)平台检测了斑马鱼脑中38种神经化学物质的变化情况，其中，多巴胺前体苯丙氨酸和血清素代谢物5-HIAA的变化与焦虑症的行为相一致，说明丙烯酰胺通过干扰斑马鱼脑中的单胺类神经递质对其造成了神经毒性。

短裸甲藻毒素(PbTxs)具有神经毒性，Yau等[63]用丹氯衍生法在LC-MS-MS上测定了青鳉鱼43种中枢神经系统的神经递质和代谢物的变化情况，来揭示PbTxs对青鳉鱼神经系统的干扰机制。研究表明，与电压钠离子通路相关的神经递质和代谢物、N-甲基-D-天冬氨酸受体、胆碱能神经递质与PbTxs的暴露显著相关。

苯并芘作为一种常见的环境污染物被认为对哺乳类动物具有的神经毒性，Wang等[64]将2 mg·kg-1bw·d-1苯并芘染毒SD大鼠7周，通过表观遗传学观察发现，苯并芘可以影响大鼠的学习和记忆能力，利用GC-MS分析大脑海马体代谢物变化情况，发现苯并芘主要干扰了酪氨酸代谢通路，为深入研究苯并芘对大鼠神经毒性的作用机制奠定了基础。

Zeng等[65]利用毛细管电泳-飞行时间质谱(CE-TOF/MS)研究了不同浓度(0、1、10和100 mg·kg-1bw)双酚A(BPA)对SD大鼠尿液代谢物的干扰，42种内源代谢物发生了变化，其中，神经递质(谷氨酸、γ-氨基丁酸和去肾上腺素)以及神经传递相关的代谢物(酪氨酸、组胺、结氨酸和牛磺酸)在BPA低剂量暴露(<50 mg·kg-1)时发生显著改变，表明环境浓度下BPA具有神经毒性作用。

4 代谢组学用于评价化学品毒性的前景展望(The prospect of metabolomics in chemical risk assessment)

虽然，很多学者坚信代谢组学技术在化学品风险评估中的有利地位，代谢组学技术仍然存在着一些挑战。利用代谢组学评价化学品毒性，目前面临的主要问题有以下几点：

(1)从复杂的代谢谱中识别出哪些是对生命体的健康有害的生物标记物，哪些代谢物的波动只是对稳态的短暂适应或变异[66]。

(2)虽然越来越多的数据表明，代谢组学将从根本上提高我们从个体水平对不良结果进行的分子预测[67]，但是目前很难将个体水平的结果外推到种群或者整个生态系统。主要原因是模式生态系统尚未建立，所以如果能够推进模式生态系统的建立则将有机会通过组学技术来评价化学品对整个生态系统的干扰机制。

(3)代谢组学在毒理学评价与管理中应用较少，这与较少的案例分析，培训机会缺失以及分析和计算工具有限有关，然而最重要的原因还是缺少标准的评价方法，包括代谢组数据库，实验方法的规范化、标准化，检测终点的量化和报告格式等方面，都需要进一步的发展。