数据挖掘技术分析神经纤毛蛋白1在脑胶质瘤中的表达及意义

张 哲，武卫周，陈 健，叶益超，钟士江

脑胶质瘤是最常见的恶性原发性实性脑肿瘤，其中51%为胶质母细胞瘤，其浸润性极强、恶性程度最高且具有易复发的特点，严重威胁人类的生命健康。2016年WHO结合分子生物标志物与传统组织学标准重新对脑胶质瘤进行了分类[1]。揭示了未来分子水平诊疗的重要趋势，从分子水平研究脑胶质瘤的发生和发展有助于开发更加有效且特异性更强的诊疗手段，对减少患者痛苦以及延长生命尤为重要。

神经纤毛蛋白1(neuropilin 1, NRP1)是由NRP1基因编码的一种大小为120～140 kDa的Ⅰ型跨膜蛋白。NRP1能够结合许多配体和各种类型的共同受体，如3类脑信号蛋白和血管内皮生长因子，广泛参与人体的生理和病理过程。现在已证实NRP1在免疫、心血管疾病发展、神经元引导、血管生成、细胞存活以及迁移等方面发挥重要作用。近年来，有学者观察到NRP1在肿瘤血管系统中广泛表达，同时NRP1的过度表达与肿瘤进展相关，且临床结果不佳[2]。许多研究表明，NRP1在肝癌、乳腺癌、胃癌中呈现高表达状态[3-5]。然而，目前NRP1与脑胶质瘤的关系研究较少，并且由于研究方法、样本量及人群差异的原因，其结论可靠性也较低。本文基于BioGPS数据库、Oncomine数据库、癌症细胞系百科全书(cancer cell line encyclopedia, CCLE)数据库的数据挖掘分析NRP1基因在脑胶质瘤中的表达及意义，为研究NRP1能否成为诊疗脑胶质瘤的潜在靶点提供理论基础。

1 资料与方法

1.1BioGPS数据库分析NRP1在人体正常组织中的表达 利用BioGPS数据库(http：//biogps.org)分析NRP1基因(210615_at)在人体正常组织中的表达情况。

1.2Oncomine数据库提取数据 Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)是一个基于基因芯片的数据库和整合数据挖掘平台，在此数据库中可根据自己的需要设定筛选条件。本文设定的筛选条件为：①Gene：NRP1；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Brain and CNS Cancer；④Pathology Subtype：Grade Type。

1.3CCLE数据库分析NRP1在肿瘤细胞系中的表达 CCLE数据库(https://portals.broadinstitute.org/ccle)是诺华公司推出的线上癌症细胞系百科全书，其对世界上药物研究和开发中使用的近1000种人类癌细胞系的遗传和分子谱进行了分类。设定搜索条件为：NRP1。

1.4统计学方法 采用Graphpad Prism 7及IBM SPSS Statistics 25统计软件进行数据分析。脑胶质瘤组织与正常脑组织间NRP1表达差异比较采用t检验。正常脑组织与不同级别脑胶质瘤间NRP1表达差异比较采用独立样本Kruskal-Wallis检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1NRP1在人体正常组织中的表达 BioGPS数据库分析表明，NRP1在人体各个正常组织中均有表达，其中在平滑肌组织、心脏、肝脏、甲状腺、视网膜、神经节及免疫细胞中表达量较高。见图1。

2.2NRP1在不同类型肿瘤组织中的表达结果 Oncomine数据库中共收集了417个不同类型的研究结果，其中关于NRP1表达有统计学差异的研究结果有30个，NRP1表达增高的研究有15个，NRP1表达降低的研究有15个。见图2。

2.3NRP1在脑胶质瘤中的表达结果 Oncomine数据库中自2006年至今有4项研究涉及NRP1在胶质母细胞瘤组织与正常脑组织中的表达，共包含922个样本。见图3。相关文献分别发表在Cancer Cell和J Clin Oncol期刊。这4项研究中3项研究表示NRP1在胶质母细胞组织与正常脑组织间表达有差异，分别是Sun Brain[6](t=12.078，P=4.49×10-21，Fold Change=8.643)、TCGA Brain(t=16.370，P=7.03×10-15，Fold Change=2.205)、Murat Brain[7](t=7.572，P=1.14×10-6，Fold Change=1.643)，另外一项研究差异无统计学意义，Lee Brain[8](t=1.348，P=0.096，Fold Change=1.308)。对这4项研究进行meta分析表明，与正常脑组织相比，NRP1在胶质母细胞瘤中高表达(P=5.70×10-7)。

图1 BioGPS数据库显示NRP1在人体正常组织中的表达

NRP1为神经纤毛蛋白1

2.4NRP1在不同级别脑胶质瘤组织中差异表达 对Oncomine数据库中Sun Brain研究(samples=180)的数据挖掘显示，4级脑胶质瘤与正常脑组织、2级脑胶质瘤和3级脑胶质瘤比较NRP1均呈高表达，且差异具有统计学意义(P<0.05)，而正常脑组织、2级胶质瘤和3级胶质瘤组间NRP1表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.5CCLE数据库分析NRP1在不同类型肿瘤细胞系中的表达 在CCLE数据库中有40种不同类型的肿瘤细胞谱系对NRP1 mRNA进行了测序，其中表达量排在前十的有软骨肉瘤、脑胶质瘤、骨巨细胞瘤、脑膜瘤、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、间皮瘤、肝癌。见图5。人脑胶质瘤位列第2，其中位表达量为4.562303。

图2 NRP1在Oncomine数据库不同肿瘤研究中的表达

NRP1为神经纤毛蛋白1；P<0.0001，fold change=2，gene rank=top 10%

3 讨论

胶质瘤占所有恶性原发性脑肿瘤的80%，其中最常见也是恶性程度最高的为胶质母细胞瘤[9-10]。我国脑胶质瘤每年的发病率约为8.8/10万，排在所有恶性肿瘤的第9位。根据目前的WHO分类，胶质瘤分为4个组织学分级。1级胶质瘤(毛细胞星形胶质瘤)生长缓慢，若完全切除可以治愈。2级胶质瘤(星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和少突细胞瘤)和更具侵袭性的3级胶质瘤(间变性星形细胞瘤)具有中间临床过程，而4级胶质瘤(胶质母细胞瘤)具有最迅猛的临床进展，即使是经过最积极的治疗，患者的中位生存期仅有14.5～16.6个月[11]。这种疾病严重威胁人们的生命安全及生活质量，越来越多的研究试图通过阐明胶质瘤的发生、发展机制，探究新的诊断和治疗方式。

NRP1是一种多功能单通道跨膜蛋白，基因位于10p11.22，包含923个氨基酸，具有一个小的胞质结合域、一个短的跨膜结合域和一个细胞外结合域。该胞外结合域由N-末端细胞补体结合域(a1/a2)、凝血因子Ⅴ/Ⅷ(b1/b2)结构域和穿膜肽酶结构域(c)组成。来自跨膜结构域的b2结构域介导与其他受体的相互作用[12]。NRP1最初被认为是神经系统中的一种黏附分子，但目前的研究主要将其作为3类脑信号蛋白受体轴突模式的配体和血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶VEGFR2的内皮细胞共受体[13]。NRP1在动物体内的神经元、血管、免疫细胞和其他类型细胞中表达，并结合一系列结构和功能外配体以调节器官的发育和功能[14]。一系列小鼠模型研究表明，NRP1是心脏、肾脏、后肢和眼睛发育中血管内皮生长因子依赖性动脉形态生长的关键性调节因子，同时可以促进人体动脉发生[15-16]。最近的研究报道显示，平滑肌细胞中NRP1的表达在主动脉或视网膜动脉的发育成熟中不起主要作用；相反，NRP1保留了胃肠道平滑肌的收缩性和运动性[17]。近年来，关于NRP1在肿瘤上的研究越来越多，其过表达与肿瘤侵袭性、病理分期和预后不良有关[18]。这可能与NRP1参与了肿瘤血管生成，增加肿瘤微血管密度、肿瘤细胞的侵袭作用相关[19-20]。

图3 NRP1在Oncomine数据库中胶质母细胞瘤中的表达

NRP1为神经纤毛蛋白1

图4 Oncomine数据库中NRP1在不同级别脑胶质瘤中的表达

NRP1为神经纤毛蛋白1；与4级脑胶质瘤比较，aP<0.05

在庞大的生物医学知识网络中，基因处于中心位置，BioGPS数据库是一个集中的线上基因注释数据库。基于BioGPS数据库挖掘的结果，NRP1在人体正常组织中广泛表达，尤其是在平滑肌组织、心脏、肝脏、甲状腺、视网膜、神经节及免疫细胞中表达量较高。侧面反映出NRP1在血管生成、轴突引导、细胞存活、迁移和侵袭等方面发挥着多方面的作用。王睿君等[21]研究表明，NRP1的表达与脑胶质瘤恶性程度呈正相关。Osada等[22]研究发现，NRP1在脑胶质瘤中过表达，且其过表达与脑胶质瘤的预后不良相关。Hu等[23]研究则发现，NRP1通过增强HGF/SF自分泌c-Met信号传导途径的活性来促进血管生成以及神经胶质瘤进展。然而，这些研究样本量较小、研究方法也不统一，可信度较低。Oncomine数据库是一项生物信息学计划，旨在收集、标准化、分析和为生物医学研究提供癌症转录组数据。目前，该数据库已经确定了18 000种癌症基因表达谱中的基因、途径和网络。通过对数据库的分析，可以查询到某种基因的表达差异、共表达分析、富集分析、meta分析等。还能结合临床资料进行二次数据分析，因其整合了大量数据、研究方法一致，分析结果具有较高的可信度。本研究通过Oncomine数据库发现，NRP1在脑胶质瘤中高表达，尤其是在胶质母细胞瘤中表达量较高。同时本研究还发现，高度恶性的脑胶质瘤(4级)较低度恶性的脑胶质瘤(2～3级)NRP1的表达量更高，但在区别低度恶性胶质瘤(2～3级)上无明显差异。这表明NRP1可能是鉴别脑胶质瘤高恶性程度的一个潜在靶点。

图5 CCLE数据库中NRP1在不同类型肿瘤细胞系中的表达

CCLE为癌症细胞系百科全书，NRP1为神经纤毛蛋白1

研究肿瘤相关基因功能的实验通常需要先筛选目的基因的高低表达，再对目的基因进行过表达或敲降，从而通过表型实验来观察功能。CCLE数据库为1100多种细胞系提供基因组数据、分析和可视化的公共访问。可以将基因表达数据可视化为箱形图或与散点图中的其他表达值进行比较。每个基因都有多个数据集和数据标识符。其中5种主要数据集类型是拷贝数，mRNA表达(Affy)，RPPA，RRBS和mRNA表达(RNAseq)。本研究利用CCLE数据库对NRP1在肿瘤细胞系中的mRNA表达进行了分析，发现在40种不同肿瘤类型的1457种细胞谱系中脑胶质瘤的表达量排在第2位。为日后研究脑胶质瘤的细胞及动物模型实验奠定了理论基础。

综上所述，本文通过对BioGPS数据库、Oncomine数据库和CCLE数据库中肿瘤相关基因信息进行深入挖掘发现NRP1在脑胶质瘤中高表达，且与胶质瘤的分级程度有关。这为深入研究NRP1在胶质瘤发生、发展中的作用奠定理论基础，同时为开发脑胶质瘤新型的临床诊疗手段提供了重要的线索和研究思路。