丹参注射液通过Nrf2/ARE通路对大隐静脉曲张的影响

(陆军军医大学第一附属医院血管外科,重庆 400038)

大隐静脉是位于下肢内侧的浅表静脉，自足部至大腿根部，再到下肢深静脉[1]。大隐静脉曲张发生的原因是长时间处于站立、静坐的状态，活动次数少，导致下肢静脉血液流动出现障碍，引发静脉迂曲扩张[2]。大隐静脉曲张是血管外科最常见的疾病之一，在我国的发病率约为10%[3]，其在体力劳动的群体中发病率相对较高，初期病情不明显，不易引起重视，但随着病情的发展，会逐渐发展为下肢水肿、小腿皮肤变黑、淤积性皮炎，晚期会发展为慢性溃疡，不易痊愈，患者活动受限制，对患者的生活及工作造成不可逆转的影响[4-6]。丹参具有扩血管、活血化瘀等功效[7]。药理研究表明，丹参可通过抑制磷酸二酯酶提高细胞内cAMP的浓度,对抗血小板聚积,促进纤维蛋白降解,降低血液高黏滞性等，从而产生抗氧化、抗凝血、抗炎、抗菌等免疫调节作用，以丹参为主的多种复方制剂已被广泛用于临床[8-9]。研究发现，Nrf2/ARE是一种有关机体防御性信号转导的通路，能使身体抵御内、外界氧化等各种刺激性的伤害，目前已成为最热点的抗氧化应激通路[10-11]。Nrf2由NFE2L2基因编码，是该信号通路重要的调控因子之一，也是活力最强的转录因子，其转录活性主要受Keapl调控[12-13]。本研究通过观察各组患者并发症、CIVIQ评分、Nrf2/ARE蛋白和mRNA表达量的差异与丹参使用的相关性，了解丹参注射液对大隐静脉曲张患者的作用，并探讨其机制，以期为临床大隐静脉曲张的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2016年1月至2017年12月于我科诊治的大隐静脉曲张患者810例，其中男456例，女354例，年龄35～78岁，平均(52.01±2.60)岁，病程(19.65±3.80)年。通过与患者沟通的治疗方案将所有患者分成对照组(未治疗)、手术组(手术治疗)和丹参组(手术治疗联合丹参注射液注射治疗)，每组270例。所有患者均对本研究知情并签署同意书。

纳入标准：术前行静脉造影，确诊为单纯大隐静脉曲张，直径增大，深静脉无血栓形成，血流通畅；表面可见下肢浅表静脉怒张、色素沉着等；久站、久坐、长时间不运动后会出现下肢酸胀沉重、抽搐、皮肤瘙痒等症状。排除标准：术前造影存在深静脉血栓、KT综合征、髂静脉压迫综合征、下腔静脉病变综合征等；经外科及静脉腔内手术(包括丹参注射液注射治疗)治疗后复发；已知对丹参注射液或含有丹参成分的药物过敏。

1.2 方法

1.2.1 大隐静脉主干高位结扎术 手术组患者取平卧位，局部麻醉后，自大腿大隐静脉主干径下段距患者侧面膝关节内侧下方3～5 cm处做1个约0.5 cm的纵向切口，在切口处挑起长度约为1 cm的大隐静脉，用4#丝线在上端和下端结扎，用0#丝线缝合切口。双下肢大隐静脉曲张者，结扎一侧大隐静脉后再结扎另一侧。

1.2.2 丹参注射液注射治疗 大隐静脉主干结扎术后，丹参组患者取站立位，用75%酒精消毒患肢，在大腿中、下1/3交界处扎止血带，从远心端向近心端逐个找取曲张静脉处，注射之前先选取注射点进行曲张浅静脉穿刺测试，观察到回抽有血后才能注射丹参注射液。每个注射点注射1～2 mL，如果遇到粗大的曲张静脉可增加剂量，但不能超过10 mL。如下肢曲张静脉较多,管腔较粗大，可以采用上下分段注射法。注射完毕后立即用棉球压迫止血，不出血后立即穿上合适的医用康复弹力套，行走30 min以防止深静脉血栓形成。

1.2.3 术后处理 术后6 h患者下床活动，每天适当行走，以促进静脉回流，预防下肢深静脉血栓形成；注意切口换药，术后10～12 d拆线；弹力绷带加压包扎3 d后改用医用弹力套；术后1周可在夜间取下弹力套，坚持穿戴6个月。

1.2.4 Western blot法检测血液内Nrf2/ARE的蛋白含量 常规方法取3组患者血液，用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭洗膜后分别加入一抗，4 ℃过夜，分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，37 ℃孵育，洗膜后加增强化学发光试剂(ECL)后置于曝光机上曝光。用Image J软件对Western blot条带进行定量分析，以目的条带和GAPDH条带积分光密度值比值作为最终结果。

1.2.5 实时定量PCR检测血液内Nrf2/ARE mRNA表达 将3组血液加入胰蛋白酶消化,进行PBS冲洗,并滴入0.9%的氯化钠溶液,放入1 mL Trizol teagent,加入2 mL RNA试剂提取RNA,取3组患者血液20 mL置于EP管中,通过A3500反转录试剂盒反转录提取到cDNA,将反转后的cDNA使用核酸凝胶染料进行目的基因的表达检测,检测仪器为CFX-96 qRT-PCR仪,使用的相关引物已通过NCBI/Primer数据库验证,反应条件:98 ℃ 6 min,溶液8 ℃ 28 s,75℃ 30 s,80 ℃ 4 min,总计55个循环。PCR循环中都可有效的变性。

表1 引物序列

1.3 观察指标及随访

根据Wong-Baker疼痛评分标准，大隐静脉曲张疼痛分为0～4分。观察3组患者色素沉着、浅静脉血栓、皮下硬结等并发症发生情况，采用CIVIQ评分评估患者的生活质量，包括社会、心理、身体体能和疼痛等 4个层面20个小项的评分(每个小项1～5分)。超声检测患者闭塞和反流率，术后1周，患者站立位，观察术肢有无残留静脉曲张。术后3、6个月返院复诊随访。采用CT静脉造影检查患者静脉管腔改善情况。Western blot法检测血液内Nrf2/ARE的蛋白含量。实时定量PCR(qRT-PCR)检测患者血液内Nrf2/ARE mRNA的表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 术后并发症情况比较

术后3个月疼痛情况见表2，对照组色素沉着、浅静脉血栓、皮下硬结等并发症发生率最高，手术组次之，丹参组最低，3组比较差异有极显著性统计学意义(P<0.01)；与术后3个月比较，术后6个月对照组并发症发生率显著升高，手术组、丹参组明显降低，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见表3。

表2 患者术后Wong-Baker疼痛量表结果比较(n=270,例)

*：与对照组比较,P<0.01;#：与手术组比较,P<0.01

表3 患者术后并发症情况比较[n=270,例(%)]

*：与对照组比较，P<0.01；#：与手术组比较，P<0.01；△：与术后3个月比较，P<0.05

2.2 术后CIVIQ评分比较

术后3个月对照组CIVIQ评分最高，手术组次之，丹参组最低，组间比较差异有极显著性统计学意义(P<0.01)；与术后3个月比较，术后6个月对照组CIVIQ评分明显升高，手术组、丹参组明显下降，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 各组术后CIVIQ评分比较分)

*：与对照组比较，P<0.01；#：与手术组比较，P<0.01；△：与术后3个月比较，P<0.05

2.3 超声检查结果比较

术后3个月，对照组闭塞和反流率最低，丹参组次之，手术组最高，3组比较差异有极显著性统计学意义(P<0.01)；与术后3个月比较，术后6个月对照组闭塞和反流率明显下降，手术组、丹参组明显升高，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见表5。

2.4 CT静脉造影检查

CT静脉造影结果显示，对照组静脉管腔内存在长短不一、持久的类圆柱形或圆柱形密度较低的造影区域，丹参组与手术组相比静脉管腔不规则狭小明显较少，部分扩张也有所缩小，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图1。

表5 各组闭塞和反流率比较[n=270,例(%)]

*：与对照组比较，P<0.01；#：与手术组比较，P<0.01

a:对照组；b：手术组；c：丹参组

2.5 Western blot法检测Nrf2/ARE的蛋白含量

Western blot结果显示，对照组的Nrf2/ARE蛋白含量最低，丹参组的Nrf2/ARE蛋白含量最高，且丹参组Nrf2/ARE蛋白含量明显高于手术组，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图2。

a: 血液内Nrf2/ARE的蛋白含量;b: 血液内Nrf2/ARE的蛋白相对表达量 *：与对照组比较，P<0.01;#：与手术组比较，P<0.01

图2 患者血液内Nrf2/ARE的蛋白含量

2.6 qRT-PCR法检测Nrf2/ARE mRNA表达量

对照组患者血液中的Nrf2/ARE mRNA表达量最低，丹参组的Nrf2/ARE mRNA表达量最高，丹参组Nrf2/ARE mRNA表达量明显高于手术组，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图3。

3 讨论

大隐静脉曲张是一种常见的下肢静脉疾病，在成年人中发病率约占50%，其特征为下肢血管如同蚯蚓状突起，在站立时尤其明显，在平躺时会消失[14-15]。研究表明，大隐静脉曲张的发病原因与长时间站立或静坐、激素、遗传等均有关系，在从事长时间站立工作和体力劳动人群中发病率高[16]。长期血液淤滞会造成下肢营养不良，可能会出现皮肤溃烂、溃疡，甚至会导致下肢深静脉血栓[17]。据文献报道，随着年龄增长，大隐静脉曲张发病率呈上升趋势，女性相较于男性发病率更高[18]。该病长期以来的治疗方法是传统外科手术。近年来，随着其他方法的深入研究，中医治疗方案也陆续出现[19]。

a: 血液内Nrf2/ARE mRNA表达量;b:血液内Nrf2/ARE mRNA相对表达量 *：与对照组比较,P<0.01;#：与手术组比较,P<0.01

图3 各组患者血液内Nrf2/ARE mRNA表达量

本研究发现，尽管手术组术后并发症、CIVIQ评分等指标较对照组明显好转，但是情况仍然不乐观。本研究在手术基础上进一步使用丹参注射液辅助治疗后发现其对于手术后的情况改善非常明显，闭塞和反流率均明显改善，管腔狭窄情况进一步减少。大隐静脉曲张患者进行静脉主干高位结扎手术后，病情得到控制，手术后注射丹参注射液的患者恢复明显加快，术后并发症明显减少，说明丹参注射液对大隐静脉曲张有治疗作用，且效果较好。Yu等[3]从丹参中分离出的一种新型天然产物Diethyl Blechnic，其通过抑制ROS和激活JNK1/2来抑制静脉曲张，而本文发现丹参注射液对于Nrf2/ARE同样具有改善作用，是否是其中Diethyl Blechnic成分的功效还需要后续深入探究。此外，有报道显示，丹参注射液联合低分子肝素钙可有效抑制静脉曲张的发展，对治疗大隐静脉曲张具有一定的促进作用，可缩短患者术后的恢复时间[20]，对于后续丹参注射液联合用药治疗大隐静脉曲张提供了借鉴。

本研究结果显示，丹参组的Nrf2/ARE mRNA和蛋白相对表达量均最高，说明注射丹参注射液能够促进Nrf2/ARE的表达，加快大隐静脉曲张患者的恢复。Zhang等[21]的研究证实丹参能够活化Nrf2/ARE，促进Nrf2/ARE mRNA的表达，加快病情好转，本研究结果与之一致。

综上所述，通过注射丹参注射液能够促进Nrf2/ARE的表达，抑制大隐静脉曲张的发展，对大隐静脉曲张有治疗作用。