复方乳酶生散杂菌检查方法验证

刘兴国 刘 荔 王月玲 田妮娜

（兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050）

复方乳酶生散是胰酶与乳酶生组成的复方制剂，由乳酶生、胰酶和葡萄糖组成，治疗消化不良、腹泻、腹胀、小儿厌食等。其活性成分乳酶生为传统的活菌素，具有微生态活菌制品的特性。杂菌是复方乳酶生散质量控制的重要指标。中国药典2015年版三部微生态活菌制品总论项下列出杂菌检查法，但并没有列出不同活菌制剂具体检测杂菌的方法[1]。为了检测复方乳酶生散的微生物限度，根据中国药典非无菌产品微生物限度检查法（四部附录1105/1106）和微生态活菌制品杂菌检查法的要求，对复方乳酶生散杂菌检查项目中的控制菌检查、非致病性杂菌和真菌计数分别开展了适用性研究，建立了复方乳酶生散杂菌检查方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器：梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统，恒温振荡培养箱。

1.2 菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]、痢疾志贺菌[CMCC（B）51252]和白色念珠菌[CMCC（F）98001]均由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 培养基：胰酪大豆胨液体培养基（TSB），胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），营养琼脂，玫瑰红钠，胆盐乳糖培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基，沙门、志贺菌属琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，北京陆桥技术股份有限提供。7.5%氯化钠肉汤培养基NAC液体培养基、NAC液体培养基由青岛海博生物技术有限公司提供。以上培养基适用性检查均符合规定。

1.4 样品：复方乳酶生散（医院制剂，批号：12011，12012，12013，活菌含量5×108cfu/g）。

2 结果

2.1 菌液制备：将枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、痢疾志贺菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，培养温度30～35 ℃，培养时间18～24 h；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDB）中，培养温度20～25 ℃，白色念珠菌培养时间为2～3 d。每种新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，备用。

2.2 供试品的处理：称取本品1 g，加到9 ml0.9%无菌氯化钠溶液制成1∶10供试液[1]。

2.3 非致病性杂菌、真菌计数方法适用性试验：①试验组：取1∶10供试液4份，分别加入制备好的菌悬液0.1 mL，混匀，使0.1 mL供试液中含菌量含菌数50～100 cfu。非致病性杂菌：取供试液0.1 mL，加到已备好的磷酸盐缓冲液营养琼脂培养基[每1000 mL营养琼脂培养基中，加人磷酸二氢钾3.56 g、磷酸氢二钠7.23 g，溶解，混匀，分装，121 ℃湿热灭菌20 min上]，以L形涂布棒涂匀，一式3份，倒置，置30～37 ℃培养，在48 h内观察结果[1]。真菌：取供试液0.1 mL，加到已备好的玫瑰红钠琼脂培养基基上，以L形涂布棒涂匀，一式3份，倒置，置20～28 ℃培养，在96 h内观察结果[1]。②供试品对照组：测定供试品的含菌量。③菌液对照组：测定每一菌株的试验菌数。见表1。

2.4 控制菌检查方法验证

2.4.1 大肠埃希菌检查方法适用性试验：取供试品lg，加到9 mL胆盐乳糖培养基中制成1∶10的匀液，加入不大于100 cfu的大肠埃希菌，混匀，培养18 h，取上述培养物0.1 mL滴加到曙红亚甲蓝琼脂平皿上，以L形涂布棒涂匀，一式3份，培养18 h，曙红亚甲蓝琼脂平皿呈紫黑色带有金属光泽的典型菌落。阴性对照组及供试品对照组均无菌落生长。

表1 非致病性杂菌、真菌计数试验结果

2.4.2 志贺菌、沙门菌检查方法适用性试验：取供试品l g，加到9 mL胆盐乳糖培养基中制成1∶10的匀液，制备两份，分别加入不大于100 cfu的痢疾志贺菌、乙型副伤寒沙门菌，混匀，培养18 h，取上述培养物0.1 mL滴加到沙门、志贺菌属琼脂平皿上，以L形涂布棒涂匀，一式3份，培养24 h，乙型副伤寒沙门菌在沙门、志贺菌属琼脂平皿呈无色透明、中心呈黑褐色的菌落。痢疾志贺菌在沙门、志贺菌属琼脂平皿呈无色、半透明、微凸、光滑的菌落。阴性对照组及供试品对照组均无菌落生长。

2.4.3 铜绿假单胞菌检查方法适用性试验：取供试品1 g，加到9 mL NAC液体培养基中制成1∶10的匀液，加入不大于100 cfu的铜绿假单胞菌，混匀，培养18 h，取上述培养物0.1 mL滴加到NAC琼脂平皿上，以L形涂布棒涂匀，一式3份，培养18 h，NAC琼脂平皿呈产绿色色素的菌落。阴性对照组及供试品对照组均无菌落生长。

2.4.4 金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验：取供试品1 g，加到9 mL 7.5%氯化钠肉汤培养基中制成1∶10的匀液，加入不大于100 cfu的金黄色葡萄球菌，混匀，培养18 h，取上述培养物0.1 mL滴加到甘露醇氯化钠琼脂平皿上，以L形涂布棒涂匀，一式3份，培养18 h，甘露醇氯化钠琼脂平皿呈金黄色菌落。阴性对照组及供试品对照组均无菌落生长。

3 讨论

3.1 微生态制剂杂菌含量检测常用的方法为显微镜检法和微生物学检验法。显微镜检法无法确切区分活菌、死菌和杂菌，只能大致了解微生物的数量；微生物学检验法主要通过平板法进行计数[2]。中国药典2015年版杂菌检查法采用涂布法进行检测。本实验控制菌检查和真菌计数将供试液涂布于选择性培养基平板的方法对复方乳酶生散进行适用性检查，结果满足要求。由于样品中含活菌数高达5×108cfu/g以上，非致病性杂菌的菌落数限度仅为样品的1/500000（中国药典规定口服微生态活菌制品成品的非致病性杂菌数不得超过1000 cfu/g）[3]，在非选择性平板上巨量的活菌会掩盖杂菌，使菌落计数非常困难，主要由于大量活菌产生乳酸改变培养基酸碱度，从而抑制杂菌的生长，因此为了增加培养基缓冲能力，使其pH值保持相对稳定，试验中改用磷酸缓冲液营养琼脂培养基，有效降低活菌对杂菌检查的干扰[4]。

3.2 杂菌检查法要求进行控制菌、非致病性杂菌总数及真菌数检查。复方乳酶生散采用常规方法均能满足方法适用性要求。

3.3 复方乳酶生散为医院制剂，归属生化药品管理，在执行微生物限度检查时，一般会出现活菌和杂菌之间相互干扰的情况，结果判断困难。本研究改良培养基的缓冲能力，有效降低了活菌的干扰。