多异瓢虫成虫对日本通草蛉集团内捕食作用的分子检测技术

王冬梅，李彩虹，刘 建

(新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】集团内竞争(Intraguild predation，IGP，集团内捕食作用)是生态系统中同一营养层中不同捕食者间的相互作用，近年来，由于此现象影响了农田生态群落结构和功能，尤其是严重干扰了害虫的生物防治，IGP越来越受到重视，因此，研究IGP，对于揭示农田生态系统中同一营养层的不同种类捕食者的互作关系和多种天敌昆虫的保护利用具有十分重要的意义[1]。【前人研究进展】捕食者的食性很复杂，不仅能捕食植食性的害虫，还取食其他捕食性与寄生性天敌昆虫。利用传统手段，如直接观察法、蛋白质电泳、肠胃分析法、多克隆抗血清免疫及单克隆抗体等方法很难准确开展捕食者食物营养关系的定量分析，而近年来快速发展的DNA追踪技术可以对捕食者和被捕食者的捕食关系进行定量分析[2-9]，也将此技术用于研究天敌昆虫的IGP。瓢虫是农田生态系统中最常见、最重要的捕食性天敌，主要取食农田的蚜虫，对于瓢虫的IGP多有报道，主要包括两方面，一是不同瓢虫种间的竞争，例如，异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)与七星瓢虫(Coccinellaseptempunctata), 斑鞘饰瓢虫(Coleomegillamaculata)、方斑瓢虫(Propyleaquatuordecimpunctata)间的相互取食[10]，异色瓢虫(H.axyridis)取食二星瓢虫(Adaliabipunctata)、十星瓢虫 (Adaliadecempunctata)[11]，以及异色瓢虫(H.axyridis)与菱斑巧瓢虫(Oenopiaconglobata.)，异色瓢虫(H.axyridis)与七星瓢虫(C.septempunctata)、龟纹瓢虫(Propyleajaponica)之间的捕食关系[12-13]。二是瓢虫类天敌与其他天敌间的竞争，如异色瓢虫(H.axyridis)取食小花蝽(Oriusinsidiosus)[14]、猫斑长足瓢虫(Hippodamiaconvergens) 对Lysiphlebustestaceipes的捕食[15]，异色瓢虫(H.axyridis)对食蚜蝇 (Episyrphusbalteatus)[16]的捕食行为等。【本研究切入点】多异瓢虫和日本通草蛉是新疆棉田中取食蚜虫的优势种和常见种，利用传统的直接观察法发现多异瓢虫对七星瓢虫和大草蛉存在IGP[17],而基于天敌中肠内容物的分子检测方法评价多异瓢虫和日本通草蛉是否存在IGP目前尚未见相关研究报道。研究利用分子检测技术评价棉田多异瓢虫对日本通草蛉的集团内捕食作用。【拟解决的关键问题】利用日本通草蛉的细胞色素氧化酶 I(COI)基因序列，设计日本通草蛉特异引物，进行多异瓢虫取食日本通草蛉的消化时间试验，评估多异瓢虫和日本通草蛉的IGP在田间的发生，研究新的分子检测技术在研究新疆棉田不同昆虫间的互作关系方面的应用。

1 材料与方法

1.1 材 料

于2018年在新疆昌吉市大西渠镇(44°15′37″，87°20′12″)棉花试验田采集各种昆虫，试验田常规管理，期间不施用任何杀虫剂。害虫类有棉蚜AphisgossypiiGlover、棉长管蚜AcyrthosiphongossypiiMordvilko、棉黑蚜AphisatrataZhang、桃蚜Myzuspersicae(Sulzer)、烟蓟马ThripstabaciLindeman、花蓟马Frankliniellaintonsa(Trybom)、西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)、二斑叶螨TetranychusurticaeKoch、土耳其斯坦叶螨Tetranychusturkestani(Ugarov et Nikolski)、截形叶螨TetranychustruncatusEhara、牧草盲蝽Lyguspratensis(Linnaeus)、棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hubner)。天敌类有日本通草蛉Chrysoperlanipponensis(Okamoto)、丽草蛉ChrysopaformosaBrauer、大草蛉Chrysoperlapallens(Rambur)、叶色草蛉ChrysopaphyllochromaWesmael、多异瓢虫Hippodamiavariegate(Goeze)、十一星瓢虫CoccinellaundecimpunctataLinnaeus、七星瓢虫Coccinellaseptempunctata、菱斑巧瓢虫OenopiaconglobataLinnaeus、方斑瓢虫Propylaeaquatuordecimpunctata(Linnaeus)、黑食蚜盲蝽DeraeocorispunctulatusFall、肩毛小花蝽Oriusniger(Wolff)、棉蚜茧蜂BinodoxyscommunisGahan、大灰食蚜蝇Eupeodescorollae(Fabricius)、条纹花蟹蛛XysticusstriatipesKoch。麦二叉蚜Schizaphisgraminum(Rondani)、麦长管蚜Macrosiphumavenae(Fabricius)、禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi(Linnaeus) 和欧洲玉米螟Ostrinianubilalis(Hubner)以及三叶草彩斑蚜Therioaphistrifolii(Monell)在试验田附近的小麦田、玉米田和苜蓿地采集。

将天敌类昆虫带回实验室饥饿处理48 h，与其他昆虫分别装入无水乙醇中，于-20℃冻存备用。

1.2 方 法

1.2.1 单头昆虫DNA提取

实验用昆虫DNA均采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明提取。

1.2.2 日本通草蛉特异引物的设计

根据日本通草蛉线粒体DNA的细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase subunit1,COI)基因(登录号为 KY806757)，利用Primer Premier 5设计特异引物 (Premier Biosoft International, USA)，送北京华大基因有限公司合成引物。筛选得到一对特异引物，上游引物CN-10F: 5′-TGGTTGAACAGTTTACCCTCCT-3′，下游引物CN-8R：5′-TGAAAGTAATAATAATAAAGCT-3′。PCR扩增反应体系 20 μL：Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL, dNTP(10 mmol/L ) 1.6 μL，10×buffer 2 μL(上述试剂来自北京全式金公司)，上游引物(20 μmol/L)0.3 μL，下游引物(20 μmol/L )0.3 μL，DNA 模板 1 μL；ddH2O 14.6 μL。PCR扩增(Bio-Rad，T100，美国)程序为：94℃预变性 3 min，然后 94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，扩增 35 个循环，最后 72℃延伸 5 min，扩增产物于-20℃保存。在含有 EB(0.5 μg/mL )的琼脂糖凝胶(1.5%)上进行电泳检测，180 V电压电泳 20 min，电泳缓冲液为 0.5×TBE。以标准分子量100 bp DNA Ladder 作为参照物检测扩增结果。

1.2.3 日本通草蛉引物的特异性检测

以日本通草蛉及与日本通草蛉同域发生的主要害虫与天敌的 DNA 为模板，用CN-10F/8R进行 PCR 扩增，检验引物的种特异性。

与日本通草蛉同域发生的节肢动物(其中害虫包括棉蚜、棉长管蚜、棉黑蚜、桃蚜、麦二叉蚜、麦长管蚜、禾谷缢管蚜、三叶草彩斑蚜、烟蓟马、花蓟马、西花蓟马、二斑叶螨、土耳其斯坦叶螨、截形叶螨、牧草盲蝽、棉铃虫、欧洲玉米螟；天敌包括多异瓢虫、十一星瓢虫、七星瓢虫、菱斑巧瓢虫、方斑瓢虫、大草蛉成虫、丽草蛉成虫、叶色草蛉成虫、肩毛小花蝽成虫、黑食蚜盲蝽成虫、棉蚜茧蜂、大灰食蚜蝇幼虫、条纹花蟹蛛成虫)的 DNA 作为模板，清水作为阴性对照，进行PCR增，检验日本通草蛉引物的种特异性。PCR 反应体系与程序同上。

1.2.4 日本通草蛉引物的灵敏性检测

为了评价特异引物对多异瓢虫中少量日本通草蛉DNA的扩增效果，将日本通草蛉DNA在核算蛋白测定仪上测定浓度，5倍稀释后进行PCR扩增，检验日本通草蛉引物的种灵敏性。PCR 反应体系与程序同上。

1.2.5 多异瓢虫对日本通草蛉消化半衰期测定

在田间采集多异瓢虫，将多异瓢虫单头至于离心管中饥饿处理48 h，仅提供湿润的脱脂棉球，用棉花堵住离心管口防治逃逸并保证通风。在田间采集日本通草蛉成虫，带回实验室，置于广口的玻璃瓶中，瓶口覆盖棉布，用10%的蜂蜜水饲养，将产有卵的棉布取下，草蛉卵不超过5 d，在4℃冰箱保存以备试验用。将饥饿处理后的多异瓢虫单头置于已放置5粒草蛉卵的离心管中，离心管置于光照培养箱中((25±2)℃，16∶8 h L∶D，湿度50%)，观察多异瓢虫的捕食情况，30 min后仍不捕食舍弃。捕食后的多异瓢虫分别在0、4、8、12、16、20、24和36 h后迅速注入无水乙醇于-20℃单头贮存。每个重复10个样品，每个处理重复3次。

1.3 数据处理

采用SPSS16.0计算多异瓢虫消化半衰期。

2 结果与分析

2.1 日本通草蛉引物特异性检测

研究表明，CN-10F/8R对日本通草蛉均具有明显的扩增效果，且条带单一清晰，所扩增片段大小为220 bp。引物对同域其它种类无扩增效果，种特异性强。图 1

2.2 日本通草蛉引物灵敏性检测

将日本通草蛉DNA模板进行5倍稀释，原浓度为366.90 ng/μL，经过5倍稀释后，在0.117 ng/μL浓度下仍可检测出。图2

注：1为日本通草蛉;2～31为同域害虫和天敌,其顺序同1.2.3;32为饥饿48 h多异瓢虫;33为空白对照;M为100 bp DNA ladder
Notes:1Chrysoperlanipponensis;2-31: pest and natural enemy of same ecological system, sequence as same as 1.2.3;32: Hippodamia variegata starved 48 h;33:blank control;M: 100 bp DNA ladder)
图1 日本通草蛉特异引物对同域的害虫天敌的种特异性检测
Fig.1 The specificity detection of special primer ofChrysoperlanipponensison pest and natural enemy of same ecological system

注：1为原始DNA浓度;2～11为依次稀释5倍的DNA浓度；M为100 bp DNA ladder
Notes: 1:Primary DNA concentration;2-11:DNA concentration in order of 5 -fold dilution; M: 100 bp DNA ladder
图2 日本通草蛉特异引物的灵敏性检测
Fig. 2 The sensitivity detection of special primer of Chrysoperla nipponensis

2.3 消化半衰期测定

取食后立即(t=0)进行处理的多异瓢虫成虫中肠内均能检测到日本通草蛉，但随消化时间的延长，扩增效果降低，检测比率下降，在4 h时，多异瓢虫成虫的可能的检出率在70%～80%，在12 h时，则下降到10%～30%，16 h 后其检出率为0。利用SPSS软件进行回归方程拟合，与Quadratic相关性最好(R2=0.991，P=0.009),其回归方程为Y=100.572-5.702x-0.045x2，通过回归方程计算，多异瓢虫取食日本通草蛉的消化半衰期为8.32 h。表1

表1 不同消化时间下多异瓢虫成虫取食日本通草蛉卵变化Table 1 Effects of digestion time on probability detecting of adult Hippodamia variegata consumed five eggs of Chrysoperla nipponensis

3 讨 论

随着 DNA 分子技术的发展，研究发现线粒体基因组的细胞色素氧化酶Ⅰ和Ⅱ(COⅠ 和COⅡ)具有较低的保守性，存在种间变异，可用于鉴定物种种类。基于DNA-based 的分子检测方法定量评价捕食者与被捕食者间的营养关系应运而生。

筛选被捕食者引物的特异性和灵敏性都将影响这种分子检测方法的准确性，被捕食者的引物在棉田和周围农田生态系统的节肢动物群落中只能对该被捕食者表现唯一性，其电泳条带需单一，清晰，条带大小在300 bp以下为好，这是由于被捕食者在天敌消化道中很容易被消化，导致被捕食者DNA 常被降解成为<300 bp 的小片段。其引物灵敏度是被捕食者在天敌消化道中的最低检出量。在研究中筛选出的日本通草蛉引物在农田生态系统的节肢动物群落中表现具有特异性，条带单一清晰，大小为220 bp，其最低检出量为0.117 ng/μL。这是利用分子检测技术评价天敌间的IGP存在的基础。

不同捕食者间消化半衰期是不同的，这导致高估或低估捕食者和被捕食者间在田间的真实发生。被捕食者在捕食者中肠中呈指数级被消化[16]，其受到被捕食者种类、消化时间长短[8]、被捕食者特异引物大小[11]、捕食者取食类型[18]和发育状态[16]等影响，而与捕食者种类无明显关系[8]。研究进行了多异瓢虫成虫取食日本通草蛉5粒卵的试验，其消化半衰期为8.32 h,与Ingels等[16]结果接近，瓢虫类天敌与草蛉类天敌间的IGP水平是基本一致，这为新疆棉田天敌的IGP研究提供了新的评价技术，为研究不同物种间的互作关系提供新途径。说明瓢虫类天敌和草蛉类天敌间存在IGP。

拟合消化半衰期的回归方程不同，其数值也不尽相同，研究中若用线性回归方程(R2=0.99，P<0.05)，半衰期为8.10 h。因此，在估算消化半衰期时应选取有显著相关性，且相关性最好的回归方程。

相比常规方法，尽管利用天敌中肠内容物的分子检测方法评价捕食者于被捕食者间的营养关系具有优势，天敌的消化半衰期的估算、被捕食者DNA的获得，天敌的饥饿时间等因素都会影响该技术方法的进一步发展。目前，高通量测序技术(next-generation sequencing ，NGS)可以大量快速的进行测序分析,为研究生态环境中的生物DNA提供了广阔的前景[20-21]。

IGP影响着集团内捕食者、被捕食者以及生物防治中害虫的种群动态，对害虫的生物防治效果有着直接影响[22,23]。新疆具有独特的农田生境，天敌种类丰富，利用分子检测技术可以准确了解IGP对农田生态的重要性。

4 结 论

利用日本通草蛉的线粒体DNA的细胞色素氧化酶基因(Cytochrome oxidase subunit1，COI)，筛选得到一对日本通草蛉特异引物，条带清晰单一，大小为220 bp，最低检测浓度为0.117 ng/μL，利用该引物测定多异瓢虫取食日本通草蛉的消化半衰期为8.32 h。天敌中肠内容物的DNA 检测技术可用于定量评估多异瓢虫与日本通草蛉集团内的捕食行为。