血清中NFL、T-tau、sNRG-1联合对阿尔茨海默症的诊断价值

伍明超,万争艳

(武汉市优抚医院精神科，湖北武汉 430023)

阿尔茨海默症(AD)是最常见的痴呆症，是一种神经退行性疾病，其特征是进行性认知衰退，例如记忆丧失和执行功能障碍，以及精神症状和行为障碍[1]。至2030年，预计痴呆症患者人数将从2 400万增加到超过6 500万[2]。目前，AD的明确诊断只能在死后进行，AD的临床诊断仍然很困难，特别是对于非专科医生[3]。目前诊断AD的方法包括详细的病史询问和神经心理学测试以确定痴呆的存在。可溶性神经调节蛋白-1(sNRG-1)是神经调节蛋白-1(NRG-1)的可溶形式，是神经调节蛋白家族成员之一，并且在神经系统中起重要作用[4]。CHANG等[5]报道，血浆sNRG-1可能是AD早期诊断的新型可靠生物标志物。微管相关蛋白Tau(T-tau)可促进微管组装和提升稳定性，并可能参与神经元极性的建立和维持[6]。T-tau在AD的临床阶段增加，并且与脑萎缩和认知衰退相关[7]。神经丝蛋白(NFL)在细胞内到轴突和树突的转运过程发挥作用[8]。IDLAND等[9]发现NFL与较低脑容量以及海马萎缩之间存在关联。基于此，本研究旨在探讨血清中NFL、T-tau、sNRG-1联合对AD的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2017年7月至2018年7月本院收治的AD患者70例为研究组，年龄60～80岁，平均年龄(73.51±8.12)岁。纳入的AD患者均根据DSM-Ⅳ临床指南进行诊断[10]，CDR评分>1、MMSE评分<24。排除标准：(1)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；(2)患有精神疾病者；(3)患有癌症者；(4)患有慢性肾病者；(5)多胎妊娠者；(6)接受相关治疗者。纳入2017年7月至2018年7月至本院体检的70例血管性痴呆患者作为对照组，年龄60～77岁，平均(72.48±7.49)岁。本研究获本院伦理委员会批准，且受试者家属均签署知情同意书。AD患者与血管性痴呆患者的基础临床资料，见表1。AD患者与血管性痴呆患者在年龄、男性比例和体质量指数等方面差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 AD患者与血管性痴呆患者的基础临床资料

1.2酶联免疫吸附试验(ELISA) 于患者治疗前采取70例AD患者和70例血管性痴呆患者的肘前静脉血6 mL，收集血液中血清置于-80 ℃冰箱保存，待样本全部收集完毕一起进行ELISA。NFL ELISA试剂盒购自上海科顺生物科技有限公司。T-tau ELISA试剂盒购自焦作路非凡生物科技有限公司。sNRG-1 ELISA试剂盒购自厦门研科生物技术有限公司(Abnova)。根据相应说明书检测2组患者血清NFL、T-tau、sNRG-1的水平。3个指标为同一批样本分批检测，去除极大值和极小值保留其余数据。使用ELISA兼容的PVC透明微量滴定板(96孔)并确定测定所需的孔数。将100 μL捕获抗体溶液分配到孔中。在板的顶部涂上密封胶带防止蒸发。将板在4 ℃孵育过夜。孵育后取出胶带并吸出每个孔试剂。每孔加入400 μL洗涤缓冲液。再将板洗涤2次，然后将倒置的板轻拍在纸巾上晾干。通过向每个孔中分配300 μL试剂稀释剂来封闭板，并在室温下孵育板60 min。将100 μL稀释的样品和标准品加入适当的孔中并盖上板。在室温下孵育平板2 h。孵育后，揭开平板并吸出每个孔。向每个孔中分配100 μL检测抗体溶液。在室温下孵育2 h并盖上板。将100 μL底物溶液分配到每个孔中。盖上平板并在室温下孵育20 min。显色后，取下盖子，每孔注入50 μL终止液，停止酶促反应。使用具有适当吸光度设置的分光光度计/读板仪立即检测每个孔的吸光度。

2 结 果

2.1AD患者与血管性痴呆患者血清中NFL、T-tau、sNRG-1的水平 AD患者血清中NFL、T-tau、sNRG-1水平均高于血管性痴呆患者(P<0.05)，见表2。

表2 AD患者与血管性痴呆患者血清中NFL、T-tau、sNRG-1的水平

注：与对照组比较,*P<0.05。

2.2AD患者与血管性痴呆患者血清NFL、T-tau、sNRG-1检测的ROC曲线、AUC、灵敏度、特异度和约登指数 为了评估血清NFL、T-tau、sNRG-1用于AD与血管性痴呆鉴别诊断的价值，绘制ROC曲线，见图1。NFL的ROC曲线的AUC为0.90(95%CI：0.848 8～0.958 4)，以740.2 pg/mL为NFL的阳性临界值，其诊断灵敏度为87%，特异度为87%；T-tau的ROC曲线的AUC为0.86(95%CI：0.793 2～0.934 6)，以448.4 ng/L为T-tau的阳性临界值，其诊断灵敏度为83%，特异度为85%；sNRG-1的ROC曲线的AUC为0.81(95%CI：0.725 7～0.898 7)，以1.59 ng/L为sNRG-1的阳性临界值，其诊断灵敏度为85%，特异度为82%。见图1和表3。

图1 AD患者与血管性痴呆患者血清中NFL、T-tau、sNRG-1的ROC曲线

2.3血清中NFL、T-tau、sNRG-1联合检测用于诊断 Logistic回归联合多指标诊断发现，血清中NFL、T-tau、sNRG-1三者联合诊断的特异度和灵敏度均高于NFL、T-tau、sNRG-1两两联合。血清中NFL、T-tau、sNRG-1联合检测对AD诊断的灵敏度为95%，特异度为83%。见图2和表4、5。

图2 血清中NFL、T-tau、sNRG-1对AD的联合诊断ROC曲线

表3 AD患者与血管性痴呆患者血清中NFL、T-tau、sNRG-1的AUC、灵敏度、特异度和约登指数

表4 NFL、T-tau、sNRG-1的Logistic回归分析

注：-表示该项无数据。

表5 血清中NFL、T-tau、sNRG-1对AD的联合诊断价值

3 讨 论

在世界范围内，AD是最常见的神经退行性疾病[11-13]。我国AD的临床漏诊率高达76.8%。目前AD的早期诊断大都依赖精神量表评分、临床症状和影像学指标等，但能常规用于临床AD诊断的检验医学生物标志物较少。因此，寻找新的生物标志物对AD的诊断和治疗至关重要。在本研究中，利用ELISA法测定血清NFL、T-tau、sNRG-1的水平后Logistic回归联合多指标诊断发现，血清中NFL、T-tau、sNRG-1三者联合诊断的特异度和灵敏度均高于NFL、T-tau、sNRG-1两两联合。血清中NFL、T-tau、sNRG-1联合对AD的诊断的灵敏度为95%、特异度为83%。

sNRG-1可诱导上皮细胞，神经胶质细胞，神经细胞和骨骼肌细胞的生长和分化[14]。在本研究中，发现AD患者血清中sNRG-1高于血管性痴呆患者(P<0.05)。血清中sNRG-1单项鉴别诊断AD患者和血管性痴呆患者的灵敏度和特异度分别为85%和82%。有研究表明，根据MMSE评分，血浆sNRG-1水平与疾病严重程度之间存在显著相关性，且与年龄存在相关性。但是，血浆sNRG-1水平与血管性痴呆患者对照组的年龄没有任何相关性[5]。因此，sNRG-1不仅反映生物学年龄并可作为衰老的候选生物标志物，可作为AD的潜在标志物。

NFL在神经元轴突中很丰富，它们对于轴突径向生长是必需的，但也存在于神经元的体细胞和树突中[15]。NFL在中枢神经系统和外周神经系统的神经元中表达，包括海马神经元[16]。因此，在神经元损伤后，NFL被释放到细胞外区室中，导致血清中NFL水平增加[17]。在本研究中，发现AD患者血清中NFL高于血管性痴呆患者(P<0.05)。血清中NFL单向诊断AD患者和血管性痴呆患者的灵敏度和特异度均为87%。以前的研究表明NFL可能反映了正在进行的神经变性的速度，且高水平的NFL与神经退行性疾病的进展相关[18]。因此，NFL可能反映出正在进行类似的神经退行性过程。

T-tau的C末端结合轴突微管，而N末端结合神经质膜组分，参与神经元极性的建立和维持[19-20]。在本研究中，发现AD患者血清中T-tau高于血管性痴呆患者(P<0.05)。血清中T-tau单向诊断AD患者和血管性痴呆患者的灵敏度和特异度分别为83%和85%。目前，靶向AD中的病理性tau蛋白和相关的tau蛋白病在动物模型中显示出巨大的潜力[21]。抗体介导的tau聚集体去除的几种互补机制可能存在协同作用，并且每种的重要性可取决于抗体性质、疾病及其阶段[22]。tau免疫疗法的临床试验已经开始，并且在不久的将来可能还会开展更多的试验[23]。因此，tau除了可作为诊断AD的潜在标志，还可作为治疗AD的潜在靶标。

然而，本研究仍然存在不足之处：(1)本研究纳入的样本量较少，仅有70例AD，相应的结果需要在更大的样本量中验证；(2)血清中NFL、T-tau、sNRG-1的水平未与精神量表评分、临床症状和影像学等临床指标做相关性分析；(3)尽管根据本研究，检测血清中sNRG-1的变化对于发现AD的风险是很重要的，但是sNRG-1的表达异常是造成AD的病因还是患AD后引起的异常仍然未知，这仍需进一步研究论证。如果是sNRG-1的表达异常导致了AD，可以通过靶向血清中的sNRG-1治疗AD患者，以改善患者的症状。