白细胞介素-37在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的表达及意义*

柯庆喜，黄 震，余红岚，陈思达，束振华，武红梅

(1.贵阳市第一人民医院检验科，贵州贵阳 550001；深圳市龙岗中心医院:2.检验科；3.内分泌科，广东深圳 518116)

类风湿关节炎(RA)是以累积周围关节为主的慢性炎症性自身免疫病，表现为滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润，以及血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等[1]。RA的发病机制尚不完全清楚，现有的研究证实炎性细胞因子网络在RA的滑膜炎症中起着关键作用，RA滑膜组织产生的细胞因子网络，是引起炎症反应、蛋白水解、细胞募集和增殖的重要介质。白细胞介素(IL)-37是一种抗炎细胞因子，目前研究发现IL-37在多种疾病中起到保护作用，特别是对系统性红斑狼疮[2]、克罗恩病[3]、病态肥胖[3]等自身免疫性疾病以及脂多糖(LPS)诱导的感染性休克方面具有明显的抗炎保护作用。活动性RA患者滑膜内层高表达IL-37，而在健康人群中却不表达[4]。IL-37作为抑炎性因子，可能通过介导一种负反馈机制来抑制炎症，这提示IL-37参与了RA的发病进程。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1对照组 收集2018年1-8月在贵阳市第一人民医院体检中心体检的30例健康标本，其中男13例，女17例，年龄23～68岁，平均(34.4±6.2)岁，经检查无急慢性病史、无遗传病家族史、无自身免疫性疾病。

1.1.2疾病组 收集2018年1-8月在贵阳市第一人民医院就诊的RA患者60例。诊断符合2010年美国风湿病学会(ACR)/欧洲抗风湿病联盟(EULAR)RA评分标准[5]。排除重度感染、严重心脑血管病、肝肾疾病、恶性肿瘤、活动性结核病。并根据临床资料计算类风湿性关节炎疾病活动性评分(DAS)，将其分为活动期RA患者30例，其中男8例，女22例，年龄20～72岁，平均(47.32±13.21)岁，稳定期RA患者30例，其中男12例，女18例，年龄26～76岁，平均(48.41±14.68)岁。本研究经贵阳市第一人民医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-37水平 采集患者清晨空腹静脉血3 mL。离心后取上清，置于-20 ℃保存待测。全部标本一次性检测。血清IL-37测定采用ELISA，试剂盒购自武汉华美生物公司。操作严格按照说明书进行。

1.2.2实时荧光定量 PCR检测 提取患者外周血单个核细胞(PBMC)，采用Trizol法提取总RNA。按宝生物Prime Script RT Master Mix试剂盒说明进行cDNA合成。IL-37基因特异性引物(根据GENBank 登录号NM_014439的IL-37的基因序列设计)及看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物均由广州英骏公司合成，引物序列见表1。采用SYBR Green实时荧光定量检测技术进行目的基因的检测，按照宝生物公司SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明在ABI Prism 7500 型荧光定量PCR扩增仪(美国ABI公司)进行定量检测。反应体系为20 μL。取样本总cDNA总量2 μL，10 μmol/L。上下游引物各0.8 μL，加入试剂盒其他成分。PCR反应条件：预变性95 ℃ 30 s后，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。每组实验重复3次。根据熔解曲线控制每个样品的扩增特异性。每一个样品目的基因扩增的循环数(Ct)都依据GAPDH进行校正，得出ΔCt(Ct目的基因-CtGAPDH)。目标基因表达差异以疾病组相对于对照组的倍数表示，即检测基因的差异为2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt疾病组-ΔCt对照组)。

1.2.3类风湿因子(RF)和抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体检测 血清RF的检测，采用日立7600全自动生化仪及配套试剂，运用免疫透射比浊法，严格按照仪器操作手册测定，血清中抗CCP抗体采用罗氏电化学发光免疫分析仪及配套试剂测定。

2 结 果

2.1RA患者PBMC中IL-37 mRNA的表达检测 以对照组细胞作为空白组样品，计算出各个实验组样品相对于空白组样品的基因相对表达量(2-ΔΔCt)。活动期RA患者组PBMC IL-37 mRNA的相对表达量与稳定期RA患者组PBMC IL-37 mRNA的相对表达量分别是对照组的3.35倍和2.19倍，差异有统计学意义(P<0.05)。而活动期RA患者组IL-37 mRNA相对表达量与稳定期RA患者组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表1 IL-37引物序列表

注：与对照组比较，*P<0.05；与稳定期组比较，#P<0.05。

图1不同组别RA患者PBMC IL-37mRNA相对表达量

2.2血清IL-37 ELISA检测结果 根据直线回归方程式代入各样本吸光度值，计算出所有样本的IL-37浓度，结果显示RA患者血清IL-37水平明显高于对照组[(71.27±23.56)pg/mLvs. (17.13±5.64)pg/mL]，差异有统计学意义(t=17.81,P=0.000)。通过临床资料分析，进一步将RA患者分为活动期组与稳定期组，结果显示与稳定期RA患者[(55.13±13.55)pg/mL]比较，活动期RA患者血清IL-37的水平[(87.41±19.68)pg/mL]明显增高，差异有统计学意义(t=8.99,P=0.000)。

表2 不同组别RA患者血清IL-37水平与病情诊断评分相关性分析

2.3RA患者血清抗CCP抗体、RF水平与IL-37水平相关性分析 RA患者血清IL-37水平与抗CCP抗体、RF抗体的水平呈正相关(r=0.468，P=0.001；r=0.384，P=0.004)，见图2、3。

2.4IL-37血清水平与RA诊断评分相关性 活动期组与稳定期组血清IL-37水平与RA患者病情诊断评分均呈正相关(P<0.05),见表2。

图2 RA患者血清IL-37水平与抗CCP抗体的相关性

图3 RA患者血清IL-37水平与RF的相关性

3 讨 论

RA是以累及周围关节为主的多系统炎症性的自身免疫病。RA的发病机制尚不完全清楚，现有的研究证实，炎性细胞因子网络在RA的滑膜炎症中起着关键作用，RA患者滑膜组织中存在着大量CD4+T的Th1细胞，它所产生的IL-1α、IL-1β和IL-18等细胞因子，具有很强的促炎作用[6]。IL-18能够活化单核/巨噬细胞，诱导干扰素-γ(IFN-γ)产生，导致RA炎症反应加重。研究表明IL-37能与IL-18BP和IL-18Rα的Fc段结合形成三元络合物，抑制IL-18的信号传导通路，促使细胞核因子κB不发生移位，减少了IFN-γ的合成[7-8]，提示IL-37可通过抑制IFN-γ的合成来减轻RA炎症反应。IL-37通过抑制树突状细胞活性来实现其抗炎作用[9]。DCs可激活RA滑膜的自身反应性T细胞,导致炎症的持续存在。本实验研究表明RA患者中IL-37水平增加，使其可以抑制树突状细胞活性，减轻DCs引起的固有免疫应答反应。IL-37与Smad3相结合发挥炎症抑制效应，研究证实Smad3参与了IL-37胞内信号转导[10]。Smad3可与TGF-β结合使Smad3磷酸化，并转移至胞核内影响基因转录，IL-37可部分通过Smad3行使其功能，促进TGF-β细胞因子抑制属性，从而发挥其抗炎功效。

研究对收集的RA患者病例，依据类风湿性关节炎疾病活动性评分标准，将其分为活动期组和稳定期组。应用实时荧光定量PCR检测RA患者PBMC IL-37 mRNA的表达，发现RA患者组的IL-37 mRNA表达量明显高于对照组，并且活动期组的上调量高于稳定期组，两组比较差异有统计学意义，提示IL-37在RA的发病过程中发挥了作用，可能参与了RA的炎症反应调节。现有的研究证实炎症因子能够上调人滑膜细胞IL-37的表达[11]。本研究应用ELISA法检测了RA患者血清IL-37水平，结果显示，RA患者血清IL-37水平显著高于对照组。活动期组IL-37水平明显高于稳定期组。进一步分析IL-37水平与RA临床指标相关性，结果表明RA患者IL-37水平与RF、抗CCP抗体水平有显著相关性，患者RA疾病诊断评分与血清IL-37水平有显著相关性，提示IL-37与RA患者严重程度呈正相关。RF和抗CCP抗体作为RA特异性诊断和判断预后的重要指标；其高滴度的抗体水平常提示患者病情较重，进展快，骨破坏严重，这提示IL-37水平与RA的病情严重程度具有一定相关性，IL-37可作为评估病情严重程度的指标而进一步指导临床诊治。

综上所述，RA患者中IL-37水平显著增加，并且活动期患者IL-37水平明显高于稳定期患者，表明IL-37参与了RA的发病过程。RA患者血清IL-37水平与RF、抗CCP抗体等RA自身抗体呈正相关，提示IL-37可作为评估病情严重程度的指标。IL-37是一种抗炎因子[12]，在RA发病机制中有重要作用，在RNA的病情判断中有潜在应用价值，但由于本试验样本量较少，试验人群范围有限，还需进一步研究与探讨。