非小细胞肺癌患者恶性胸腔积液及外周血T790M 突变检测的应用价值

黄芳芳 赵振中 陈 佳 汪铁军

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%～85%[2-3]。多数患者在确诊时已无手术机会，放化疗及分子靶向治疗成为其主要的治疗方法。基因检测是靶向治疗的前提，然而由于患者意愿或不能手术等种种原因，肿瘤活检或手术切除的组织标本获取较为困难，多次取材活检更是难以实现。因此，临床研究者一直试图寻找其他标本来替代肿瘤组织标本。目前研究较多的是外周血及胸腔积液，取材方便，且相对无创。本研究通过收集40 例NSCLC 患者的恶性胸腔积液及外周血标本，进行T790M 基因检测，并与组织标本的T790M 突变情况进行比较，探讨恶性胸腔积液、外周血标本作为组织标本的备选替代标本用于T790M 基因检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年5 月—2019 年6 月杭州市余杭区第二人民医院NSCLC 患者的恶性胸腔积液及外周血标本各40 例，所有患者经组织病理学确诊为NSCLC 且伴有恶性胸水。本研究经杭州市余杭区第二人民医院医学伦理委员会审核，所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入标准（1）组织病理学确诊为NSCLC；（2）可进行组织学基因检测或者已经有组织学基因检测结果；（3）B 超证实有胸腔积液且能进行穿刺取样，病理细胞学证实胸水中有肿瘤细胞。

1.3 标本收集及检测 取活检或手术标本进行石蜡包埋，经两位病理医师质控确定为NSCLC，且癌组织≥30%。切取5～10 片约5～6μm 厚的切片放入Ependorf 管中，加入二甲苯脱蜡后用乙醇清洗，晾干。再加入20μL 蛋白酶K 及200μL 裂解液Buffer DTL，震荡混匀后消化1h，静置离心，用厦门艾德公司的核酸提取试剂盒收集提取DNA。同时采集患者外周血50mL，存于抗凝管中，及胸腔积液250～500mL，均2～8℃条件下保存，24h 内3000rpm 离心10min，沉淀涂片并进行病理质控，单个视野下肿瘤细胞数＞10 个视为病理质控合格；合格者采用离心法分离沉淀中的肿瘤细胞与血细胞；胸水沉淀细胞采用胸水样本DNA 分离试剂盒及RNA 分离试剂盒提取胸水中的核酸。所有收集提取的DNA 均使用艾德公司的人类EGFR 基因21 种突变检测试剂盒（荧光PCR 法）进行T790M 检测。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.0 软件进行统计分析，用卡方检验分别比较胸腔积液、外周血标本与组织标本中T790M 基因突变的差异，及胸腔积液与外周血标本T790M 突变的差异。P<0.05 为差异有统计学意义。用Kappa 系数进行一致性检验，Kappa>0.75为一致性极好，0.4≤Kappa≤0.75 为一致性良好，Kappa<0.4 为一致性差。

2 结果

本组共40 例，男28 例，女12 例，女性突变率75.0%（9/12）显著高于男性35.7%（10/28）。年龄＜60岁患者19 例，＞60 岁患者21 例，年龄组突变率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。组织病理学类型：腺癌患者16 例，T790M 突变12 例，鳞癌患者24 例，T790M 突变7 例，突变率29.2%，显著低于腺癌的75.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）。未使用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物17 例，有2 例T790M 突变阳性，TKI 耐药后标本23 例，17 例阳性，突变率达73.9%，远高于用药前患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

40 份组织标本中，检出T790M 突变共19 例，突变率47.5%。对应恶性胸腔积液标本，检出T790M 突变共15 例，突变率37.5%，两者Kappa 值0.797，提示一致性极好，差异有统计学意义（P＜0.01）。外周血检出T790M 突变例数共11 例，突变率27.5%，与组织标本Kappa 值0.591，提示一致性较好，差异有统计学意义（P<0.01）。外周血与恶性胸腔积液相比，Kappa 值0.662，一致性较好，提示无明显差异。所有标本中，未出现组织标本阴性，恶性胸腔积液或外周血标本阳性情况。组织标本T790M 阳性患者19 例，有17 例使用奥西替尼口服靶向治疗，用药1 个月后复查胸部CT，其中可测量病灶缩小25%以上患者1例（5.9%），病灶略缩小25%以下患者7 例（41.2%），病灶稳定无明显变化患者5 例（29.4%），剩余4 例患者病灶增大（23.5%）。

表1 T790M 基因突变与性别、年龄、病理类型相关性

3 讨论

分子靶向药物因其特异性高，副作用小，在延长患者生存时间和提高生活质量方面发挥了越来越重要的作用。其中，又以表皮生长因子（EGFR）-TKI 疗效最为显著[4-5]。EGFR-TKI 能明显延长晚期EGFR突变阳性的NSCLC 患者的无进展生存期（PFS），因此被推荐为该类患者的一线治疗方案[6]。然而，治疗过程中，耐药几乎不可避免。即使对初始EGFR-TKI治疗应答良好，然而几乎所有服用EGFR-TKI 的患者在平均治疗10 个月后都会对此类药物出现耐药[7]。国内外研究表明，50%的耐药患者存在EGFR 基因20 号外显子第790 位点的突变，即T790M 基因突变，并且与EGFR-TKI 疗效密切相关[8]。目前已有第三代EGFR-TKI 例如奥西替尼针对T790M 突变患者的治疗，疗效显著[9]。因此在治疗期间连续动态监测分析T790M 突变状态及患者的临床特征，可为临床提供更多有用的信息，从而指导治疗方案的制定。活体组织标本的获取主要依靠肿瘤活检或手术切除组织，受患者主观意愿、客观条件及病灶位置等影响较大，反复多次取材存在很大难度，且创伤较大。IPASS 研究纳入的1038 例患者中只有681 例能够提供标本，最后仅437 例患者能够评价EGFR 基因突变状态[10]。国内的一项多中心调查表明，2009 年中国患者EGFR 突变检测的比例仅有9.6%，而2012年有所上升也只有20%，这提示大多数患者无法获取足够的标本用于基因检测[11]。相对来说，外周血及恶性胸腔积液作为组织标本替代品应用于临床耐药基因T790M 检测，存在显著优势：一是较容易获取，可多次采样，从而形成一个动态监测过程；二是外周血及胸腔积液多为治疗需要时获取，即仅在患者出现临床相关症状需要治疗时获取，相对创伤较小，因而患者接受度较高；第三，相对于组织学固态标本取样的局限性，外周血及胸腔积液液态标本的灵动性，所含有的肿瘤信息或许更加丰富。

本组40 例患者年龄介于32～81 岁之间，均有组织学T790M 基因检测结果，其中女性突变率明显高于男性，可能与女性中非吸烟腺癌患者较男性中非吸烟腺癌占比高有关。腺癌患者T790M 突变率明显高于鳞癌患者，TKI 治疗耐药后的T790M 突变率亦明显高于治疗前患者，提示TKI 治疗可能是引起T790M 突变发生的主要原因。组织标本中，检出T790M 突变共19 例，突变率47.5%。对应恶性胸腔积液T790M 突变的检出率比较，两者Kappa 值0.797，一致性极好。对应外周血T790M 突变检出率27.5%，两者比较Kappa 值0.591，一致性较好，两者均有统计学意义，因此，可以认为恶性胸腔积液及外周血作为组织标本的替代标本进行T790M 检测，具有一定的可行性。另外，恶性胸腔积液的突变检出率相对外周血较高，前者与组织学标本比较所得Kappa 值明显高于后者，考虑恶性胸腔积液可能更占优势，这可能与恶性胸腔积液中病理质控及多态性有关。但因标本数量的限制，结果存在一定的局限性，期待进一步的大样本探讨研究。

综上所述，临床工作中，若遇到组织标本不能获取的情况，不妨尝试考虑使用恶性胸腔积液替代进行T790M 检测，若两者皆不易获取，使用患者外周血标本进行T790M 检测也是一个选择。