聚乙二醇型超支化聚酯胺的制备及表征

高 翔， 罗 静， 钱佳怡， 梁 雪， 张一帆， 李小杰， 陈明清

（江南大学化学与材料工程学院，合成与生物胶体教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

超支化聚合物是继线形、支链形和交联聚合物之后一类新型的合成高分子[1,2]。与线形聚合物不同，超支化聚合物具有高度支化、三维椭球状结构、表面官能团丰富等与树枝状聚合物类似的特点，能包埋和化学键合客体分子，并可以进行功能改性。由于其独特的分子结构、物理化学性质以及简单的合成步骤，超支化聚合物被广泛关注[3,4]，在纳米载体、催化、光电材料等领域已经展现了巨大的应用潜力[5,6]。

近年来，生物相容性好、具备生物降解能力的超支化聚合物的合成及应用已经成为研究热点[7]。国内外科学家们通过对超支化聚合物分子结构进行设计，构筑了很多可生物降解的超支化聚合物。科学家们合成了可在pH、氧化还原、蛋白酶等作用下降解的超支化聚合物，包括聚缩酮羟基醚[8]、聚酰腙[9,10]、聚磷酸酯[11-13]、聚多肽[14]等超支化聚合物，研究了它们的自组装行为，以及在药物输送领域的应用。在基因治疗研究方面，科学家们通过将二硫键[15-17]或者酯键[18]引入超支化聚合物骨架，合成了可生物降解的超支化聚（酰胺-胺）和超支化聚酯胺，与不能生物降解的超支化聚乙烯亚胺（HPEI）相比，它们的细胞毒性大大降低，提高了超支化聚合物在基因治疗应用中的安全性。其中超支化聚酯胺大多采用碳链的二丙烯酸酯类化合物作为A2单体（含有两个A 基因的单体，其余类推）通过迈克尔加成聚合反应制得，此类超支化聚酯胺的水溶性和生物相容性较差，而聚乙二醇（PEG）是一种用途广泛的醚类高分子化合物，具有良好的水溶性和生物相容性，在生物体内能溶于组织液中，能被机体迅速排出体外而不产生毒副作用，而且当把PEG 和其他分子偶合时它的许多优良性能也会随之转移到结合物中[19，20]。利用PEG 对超支化聚酯胺表面进行改性，可使其水溶性得以改善。朱新远等[21]利用聚乙二醇二丙烯酸酯的A2单体和胺类的B4单体通过迈克尔加成聚合反应合成了端胺基的超支化聚酯胺并用于基因转染领域，但此A2+B4聚合方法会产生凝胶化现象，不适用于合成端基为丙烯酸酯的超支化聚合物。

本文首先以含PEG 长链的聚乙二醇二丙烯酸酯为A2单体，N-乙基乙二胺为B'B2单体，合成了表面含丙烯酸酯键、骨架含PEG、内部含叔胺的具有三维椭球状结构的超支化聚酯胺。然后利用咪唑中的胺基与丙烯酸酯键的迈克尔加成反应，对超支化聚酯胺进行功能化改性，并对改性后超支化聚酯胺的化学结构和分子组成进行了表征，初步研究了其水溶性和pH 响应性。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）：化学纯，西格玛化学试剂有限公司；N-乙基乙二胺、N-甲基咪唑：化学纯，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；咪唑、二甲基亚砜（DMSO）、氯仿、无水乙醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 测试与表征

核磁共振（NMR）谱仪（瑞士Bruker 公司AVANCE 400 MHz 型）：以DMSO-d6或CDCl3为溶剂，四甲基硅氧烷为内标；傅里叶红外（FT-IR）光谱仪（中国赛默飞世尔科技公司Nicolet iS50 型）：采用溴化钾涂膜制样，波数范围500～3 000 cm-1，分辨率为2 cm-1；凝胶渗透色谱仪（美国沃世特公司Waters GPC 486 型）：以四氢呋喃（THF）为流动相，PEG 为标准样；Zeta 电位及纳米粒度分析仪（美国布鲁克海文仪器公司 Zeta PALS 型）：采用钯电极测量，扫描时间5 min；GPC-MALLS 多角度激光散射系统（美国怀雅特技术公司DAWN HELEOS II型）：以N，N-二甲基甲酰胺为流动相，样品质量浓度为10 mg/mL。

1.3 实验步骤

1.3.1 超支化聚酯胺的合成 向圆底烧瓶中加入PEGDA（0.02 mol）、30 mL DMSO（0.2 g/mL），在60 ℃下搅拌均匀并且通氮排除空气，将N-乙基乙二胺（0.882 g，0.01 mol）加入到烧瓶中，避光反应24 h，得到超支化聚酯胺。依据原料PEGDA 的数均分子量250 和575，将样品分别标记为HBPAE-250 和HBPAE-575。合成路线如图1 所示。

1.3.2 咪唑功能化超支化聚酯胺（HBPAE-imidazole）的合成 向100 mL 圆底烧瓶中加入PEGDA（Mn=250，5.000 g，0.02 mol）、30 mL DMSO，在60 ℃下搅拌均匀并且通氮排除空气，将N-乙基乙二胺（0.882 g，0.01 mol）加入到烧瓶中，避光反应24 h。将N-甲基咪唑（0.164 g，2 mmol）、咪唑（2.042 g，0.03 mol）加入烧瓶中，并升温至70 ℃，避光反应24 h。反应结束后将反应溶液在无水乙醚中沉淀、氯仿溶解，沉淀-溶解3 次，最终旋转蒸发得到黄色黏稠液体HBPAE-imidazole 6.235 g，产率为78.69%。

图 1 超支化聚酯胺的合成路线Fig. 1 Synthesis route of hyperbranched poly(amino-ester)

2 结果与讨论

2.1 超支化聚酯胺的合成

由PEGDA 和N-乙基乙二胺合成超支化聚酯胺的合成机理如图2 所示。由于N-乙基乙二胺中伯胺的反应活性高于仲胺，所以双键会先与伯胺进行迈克尔加成反应，生成AB2型中间体，进而发生AB2型单体的自缩聚，最终生成超支化聚酯胺。

图 2 超支化聚酯胺的合成机理Fig. 2 Synthesis mechanism of hyperbranched poly(amino-ester)

反应过程中对样品不提纯进行实时核磁检测，利用1H-NMR 谱图中各基团的化学位移及积分比例来确定聚合反应程度。图3（a，b）分别为不同反应时间下HBPAE-250、HBPAE-575 的1H-NMR 谱图，化学位移4.0～4.1 处为与酯基相连的亚甲基质子峰，4.1～4.3 处为与丙烯酸酯基相连的亚甲基质子峰，5.8～6.5 处为丙烯酸酯键上的双键质子峰。随着反应的进行，与丙烯酸酯基相连的亚甲基和双键的质子峰积分面积逐渐减小，与普通酯基相连的亚甲基质子峰积分面积逐渐增加，通过核磁谱图中积分面积的变化，可以计算聚合反应的程度。聚合反应程度与时间的关系如图3（c，d）所示。由图3（c，d）可见，两种体系的聚合反应程度都随着时间的增加而增加，HBPAE-250 体系在反应到24 h 时聚合反应程度达到99.0%，反应48 h 时达到100%；HBPAE-575 体系在反应到24 h 时，聚合反应程度仅为70%，反应48 h 时仅达到78%。

图 3 不同时间下HBPAE 的1H-NMR 谱图（a，b）和聚合反应程度（c，d）Fig. 3 1H-NMR spectra （a, b） and degree of polymerization （c,d） of HBPAE at different time

与HBPAE-250 相比，HBPAE-575 由于A2单体分子量的增大，链长度增大，导致分子链两侧的丙烯酸酯基团反应位阻增大，反应活性降低，聚合反应程度降低。因此，本文将反应体系温度提高至80 ℃进行反应，并利用1H-NMR 监测反应的进行，结果汇总于表1。由表1 可见，当体系反应温度为80 ℃，反应时间为48 h 时，HBPAE-575 体系聚合反应程度仅有80.0%，聚合反应程度提高不明显。当继续提高反应温度至100 ℃时，聚合反应体系极易发生凝胶。

研究表明，合成表面含丙烯酸酯键、骨架含PEG、内部含叔胺的具有三维椭球状结构的超支化聚酯胺的反应条件是：A2单体为Mn=250 的PEGDA，反应温度为60 ℃，反应时间为24 h。

表 1 不同时间和温度下的聚合反应程度Table 1 Degree of polymerization at different time and temperatures

2.2 HBPAE-250 的结构表征

超支化聚酯胺的化学结构如图4 所示。HBPAE-250 提纯后的1H-NMR 和FT-IR 谱图如图5 所示。HBPAE-250 的核磁共振氢谱图中，化学位移2.5～3.0 处出现与N 相连亚甲基的质子峰，4.0～4.1 处出现与酯基相连的亚甲基的质子峰，4.1～4.3 处为与丙烯酸酯基相连的亚甲基质子峰，5.8～6.5 处为丙烯酸酯键上的双键质子峰，其他质子峰的位置以及积分面积如图5（a）所示。HBPAE-250 的红外谱图中，1 734 cm-1处出现了―C＝O 的伸缩振动峰，1 360 cm-1处出现了C―N 的伸缩振动峰。结果表明，超支化聚酯胺合成成功。

由于HBPAE-250 不能通过核磁共振氢谱计算其支化度，因此通过GPC-MALLS 对其拓扑结构进行表征，结果如图6 所示。图6 为HBPAE-250 的Mark-Houwink-Sakurada 曲线。测试得到Mark-Houwink 参数（α）为0.417，超支化聚合物的α 一般为0.2～0.5[22]，证明HBPAE-250 具有高度支化结构。

2.3 HBPAE-imidazole 的结构表征

图 4 超支化聚酯胺的结构式Fig. 4 Chemical structure of hyperbranched poly(amino-ester)

图 5 HBPAE-250 的1H-NMR（a）和红外谱图（b）Fig. 5 1H-NMR （a） and FT-IR （b） spectra of HBPAE-250

HBPAE-imidazole 的结构式、1H-NMR 图谱、FT-IR 光谱和GPC 曲线如图7 所示。HBPAE-imidazole 的1H-NMR 谱图中，5.8～6.5 处丙烯酸酯键上的双键质子峰消失，6.8～7.5 处出现咪唑上亚甲基的质子峰，其他质子峰的位置和积分面积如图7（b）所示。HBPAEimidazole 的红外谱图中，1 360 cm-1处为C—N 的伸缩振动峰，其他基团特征峰如图7（c）所示。通过HBPAE-imidazole 的GPC 曲线测得其Mw=1.42×103，Mn=1.36×103，PDI=1.05。结果证明HBPAE-imidazole已成功合成。

图 6 HBPAE-250 的Mark-Houwink-Sakurada 曲线Fig. 6 Mark-Houwink-Sakurada curves of HBPAE-250

2.4 超支化聚酯胺的水溶性和pH 响应性

将HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 分别溶解于pH 为7.4 和6.0 的PBS 缓冲液（20 mg/mL）中，溶液的数码照片如图8 所示。从图8 可观察到，在pH 为7.4 和6.0 的缓冲液中，HBPAE-250 和HBPAEimidazole 都呈淡黄色透明状，表现出良好的水溶性。但是HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 在pH 为7.4 的缓冲液中溶解时间略长，这是因为两者内部均含大量叔胺，在酸性条件下，叔胺发生质子化，聚合物携带大量正电荷，从而导致聚合物的溶解更快。结果表明PEG 的引入赋予了超支化聚酯胺水溶性。

图 7 HBPAE-imidazole 的结构式 （a），1H-NMR 谱图 （b），FT-IR 谱图 （c） 和GPC 曲线 （d）Fig. 7 Chemical structure （a）, 1H-NMR spectrum （b）, FT-IR spectrum （c） and GPC curve （d） of HBPAE-imidazole

图 8 HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 在不同pH 的PBS 缓冲液中的数码照片Fig. 8 Photos of HBPAE-250 and HBPAE-imidazole in PBS buffer at different pH values

图 9 不同pH 下HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 的Zeta 电位Fig. 9 Zeta potential of HBPAE-250 and HBPAE-imidazole at different pH values

将HBPAE-imidazole 和HBPAE-250 分别溶于PBS 缓冲液（20 mg/mL）中进行Zeta 电位测试，结果如图9 所示。两种聚合物的Zeta 电位随着pH 的增大而减小，这是因为HBPAE-250 和HBPAE-imidazole内部均含大量叔胺，在低pH 时，叔胺易发生质子化，使聚合物携带大量正电荷；而相同pH 下HBPAEimidazole 的Zeta 电位远比HBPAE-250 的Zeta 电位高，这是因为HBPAE-imidazole 表面含有大量咪唑基团，叔胺数量远高于HBPAE-250，导致叔胺质子化后，携带的正电荷数量更多。结果表明咪唑基团的引入大大提高了超支化聚酯胺的pH 响应性。

3 结 论

（1）合成表面含丙烯酸酯键、骨架含PEG、内部含叔胺的具有三维椭球状结构的超支化聚酯胺的适宜条件：A2单体为Mn=250 的聚乙二醇二丙烯酸酯，反应温度为60 ℃，反应时间为24 h。

（2）聚乙二醇的引入赋予了超支化聚酯胺水溶性。

（3）利用咪唑对骨架含PEG 的超支化聚酯胺进行功能化改性，提高了超支化聚酯胺的pH 响应性。