不同剂量生殖激素对小鼠超排效果的影响

（ 固原市民族职业技术学院，固原 756000 ）

在动物胚胎生物技术的研究和应用中需要大量的优质卵子和胚胎，获取大量卵母细胞或早期胚胎的有效途径之一就是超数排卵（简称超排）[1]。如今，绝大多数胚胎移植中心都采用超数排卵方法来获得较多的卵母细胞。而小鼠为医学、生物研究领域应用最广的实验动物之一，特别是随着胚胎工程的深入研究，获得足够数量的小鼠胚胎是顺利开展各种胚胎生物实验的基础。对于小鼠超数排卵，现在国内外均有较多研究[2,3]。但是在养牛业中，特别奶牛超数排卵反应是一个极其复杂的生理过程，它受动物遗传特性、体况、营养状态、年龄、发情周期的阶段、卵巢的功能状态、季节、温度以及激素的品种与用量等多种因素的影响，这些因素错综复杂，使超排效果很不稳定。本试验主要研究激素剂量和激素注射间隔时间两种因素对小鼠超排效果的影响，找出激素最佳剂量组合及注射时间间隔，以期为今后的小鼠及其他动物包括奶牛的超排工作提供一定的参考依据。

1 材料

1.1 试验动物

试验动物选用优质级昆明系小鼠90只。经过雌雄鉴别，雌鼠70只，雄鼠20只，均为5～6周龄，在恒温（24～25℃）条件下，自由采食、饮水。

1.2 试剂及器材

人绒毛膜促性腺激素(1000IU×10)，苏州市苏牧动物药业有限公司产品；孕马血清促性腺激素（1000IU×5），宁波市激素制品有限公司产品；PBS液( A、B液，pH值7.2 )，自行配制。

体视显微镜(LEICA-ES2型、LEICA-ES4型)，北京悦昌行科技有限公司；生物安全柜（BSC-1100ⅡA2-X），济南正荣医疗器械有限公司。

2 试验设计

2.1 不同PMSG与HCG剂量组合对小鼠超排效果的影响

设计5个试验组，每组10只（随机抽取）放入悬挂鼠笼中，分别标记为：5IU PMSG+5IU HCG组，7.5IU PMSG+7.5IU HCG组，10IU PMSG+10IU HCG组；12.5IU PMSG+12.5IU HCG组，另外1个对照组。首先向5个试验组的雌性小鼠腹腔中分别注射5、7.5、10、12.5IU的PMSG，48h后分别注射5、7.5、10、12.5IU的HCG，对照组注射生理盐水。在注射HCG 6～10h后颈部脱臼处死，剪开皮肤，用眼科镊拉出小鼠左右两侧子宫和卵巢，把输卵管与子宫、卵巢分离，找出输卵管的膨大部，浸泡在装有生理盐水的平皿中，在体视显微镜下，用胚胎操作针将卵分离出来，再加入透明质酸酶（HE液），2～3min观察计数。

2.2 PMSG与HCG的不同注射间隔时间对小鼠超排及子宫的影响

设计5个试验组，每组4只（随机抽取）放入悬挂鼠笼中，分别标记为5、7.5、10、12.5IU组，另外1个对照组。首先向5个试验组的雌性小鼠腹腔中分别注射5、7.5、10、12.5IU的PMSG，然后分别在44、46、48、52h后腹腔注射10IU的HCG，在注射HCG后与性成熟的雄鼠（雌性比例为2:1）合笼悬挂饲养过夜，对照组注射生理盐水。在见栓后第3天将小鼠脱臼处死，剪出输卵管、子宫和卵巢，先在体视镜下观察卵巢上红体的情况，再观察两个子宫的颜色和体积等。

2.3 数据统计分析

利用SPSS17.0软件进行方差分析和多重比较，确定差异的显著性。结果表示为平均值±标准差。

3 结果与分析

3.1 不同PMSG与HCG剂量组合对小鼠超排效果的影响

表1 不同PMSG与HCG剂量组合对小鼠超排效果的影响

从表1可以看出，(1 0+1 0)I U剂量组合和(12.5+12.5)IU剂量组合见栓率分别为81%和76%，差异不显著（P＞0.05），但均显著高于(5+5)IU和(7.5+7.5)IU剂量组合的50%和62%。另外，激素剂量组合(10+10)IU的见栓小鼠平均获卵数(10.3枚)显著高于(5+5)IU组合(7.2枚)、(7.5+7.5)IU组合(8.0枚)，差异显著（P＜0.05）。可见，激素组合(10+10)IU优于其他三种激素剂量组合。

3.2 PMSG与HCG的不同注射间隔时间对小鼠超排的影响

表2 PMSG与HCG的不同注射间隔时间对小鼠超排的影响

试验结果表明（表2），PMSG与HCG注射时间间隔44h、46h、48h的见栓小鼠平均获卵数分别为6.3枚、7.2枚和8.4枚，三者差异不显著（P＞0.05），而注射时间间隔50h的见栓小鼠平均获卵数为4.6枚，与上述时间差异显著（P＜0.05）。故认为PMSG与HCG注射时间间隔以44～48h为宜，且48h平均获卵数最高。

3.3 不同PMSG剂量对小鼠子宫的影响

用5、7.5、10、12.5IU 4种PMSG剂量处理4只小鼠，HCG注射剂量为10IU，观察其子宫的形态特征。结果10IU PMSG时的子宫发育较显著，子宫粗而均匀，色泽深红，充血明显。观察结果见表3。

表3 不同PMSG剂量下子宫发育的形态比较

表3结果表明，PMSG注射剂量过低，不足以刺激较多的卵泡成熟，达不到超排的目的；注射剂量过高，对于子宫刺激明显，造成子宫肿大、高度充血，卵巢易发生囊肿，从而减少了排卵数，同样也达不到理想的排卵效果。故(10+10)IU激素组合范围处理对小鼠子宫影响较好，至于更精确的组合剂量还有待进一步的研究。

4 讨论

哺乳动物初生时卵巢上有20万～40万个卵母细胞，但在自然条件下，仅有极少部分卵母细胞得以正常发育并排卵。哺乳动物发情周期中，垂体所分泌的激素只能保证1个或部分卵泡发育成熟，若此期间给予大量外源激素或类似物，可诱发大量卵母细胞发育，排卵数可超过正常排卵数的若干倍[4]。

目前，用于小鼠和大多家畜超数排卵的激素组合主要是PMSG+HCG和FSH+HCG，在激素的使用剂量方面，不同试验差别较大，因此所获得的结果也不尽相同。本试验采用PMSG+HCG方案，结果表明，用(10+10)IU的PMSG+HCG组合方案的平均见栓率与(12.5+12.5)IU方案差异不显著，但均显著高于组合(5+5)IU和(7.5+7.5)IU方案，这可能与超数排卵受到多种因素的影响有关[5]。如动物本身因素，包括个体和遗传的差异，年龄、生理和营养状态，季节及环境的适应性等；药物的半衰期、给药途径、剂量的保证；试验数据的统计、卵母细胞的收集、计数等[6]。另外，激素剂量组合(10+10)IU的见栓小鼠平均获卵数显著高于组合(5+5)IU、(7.5+7.5)IU和组合(15+15)IU，差异显著。在PMSG与HCG的不同注射间隔时间对小鼠超排的影响试验中看出，PMSG与HCG注射时间间隔控制在44～48h为宜，以48h排卵最多。

通过对不同PMSG剂量下子宫发育的形态比较发现，小鼠在(10+10)IU的PMSG+HCG组合下，子宫不论从大小形态、颜色还是充血程度上都优于其他几组。这可能与小鼠个体之间的阈值有关[7]。相同剂量的激素在阈值较低的小鼠上表现为卵巢“过刺激”而减少卵母细胞排放率，在阈值较高的小鼠上表现为激素含量不满足致使卵母细胞不发育，同样也达不到理想的超数排卵效果。本文就激素注射剂量、注射时间间隔以及不同剂量和组合对于小鼠平均可用胚胎率的影响。另外，遗传、身体状况、生存环境、卵泡生长情况和内分泌活动等因素对小鼠超排的影响还有待进一步深入研究。

目前，在养牛业生产上，奶牛超数排卵技术的效果往往受多种因素影响，如激素处理方法、激素剂量、处理时间、季节等，导致了超数排卵效果差异较大，严重影响了推广应用。由于直接在奶牛上研究激素对其超排及繁育能力的影响代价较大，所以借助小鼠为研究对象，从激素处理剂量、处理时间等进行对比研究，找出最佳组合，为同行在今后的课题研究上、奶牛健康养殖上提供参考。