正常盐饮食状态下醛固酮增多对大鼠心肌的影响及其机制研究

心肌纤维化是多种心血管疾病导致心脏扩大、衰竭的终末期表现，其主要病理表现为心肌细胞增殖、细胞外胶原蛋白过度沉积，病因十分复杂，相关调控机制受多种因素影响[1]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)是近年来国内外研究的热点，而醛固酮作为RAAS中的关键效应分子，其在心肌纤维化的发生、发展中发挥着重要作用。许多研究发现，醛固酮不仅是一个可致多器官纤维化的活性因子，而且是一个促炎反应因子和促血管钙化因子[2-4]，是独立的心血管危险因素之一。本课题组前期研究发现，外源性醛固酮不仅可导致大鼠主动脉纤维化改变，同时有研究亦发现醛固酮增多可导致心肌纤维化[5]，但其可能涉及的分子途径尚未完全明了。据此，本实验拟在正常盐饮食情况下观察醛固酮增多对大鼠心肌的影响，并初步探讨可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品 8周龄雄性SD大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。醛固酮购自Sigma公司，血清单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)放免试剂盒购自北京华英公司，MCP-1受体一抗购自北京博奥森公司，二抗购自北京中杉金桥公司。其余为进口或国产分析纯试剂。

1.2 实验分组及标本收集 16只雄性SD大鼠随机分两组，每组8只。 正常对照组：给予等量的生理盐水肌内注射；醛固酮组：采用醛固酮皮下注射(20 μg/d)，常规饲养6周。称重后2%戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，置入含有促凝剂的试管中，静置析出血清，4℃离心10 min，分离血清，-70 ℃保存。摘取心脏，用冰生理盐水冲洗后称重，切除部分心肌组织，石蜡包埋用于染色。

1.3 心肌组织胶原Masson染色 取大鼠心肌组织石蜡块，制作4 μm厚切片，常规脱蜡、水化、脱水，Masson复合染色液5 min，0.2%醋酸水溶液稍洗，5%磷钨酸5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，亮绿染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次，经脱水、透明、封片，在光镜下观察。

1.4 放射免疫法检 测心肌组织和血清MCP-1的表达 取大鼠心肌组织和血清标本，送至北京华英生物研究所，采用放射免疫法检测。

1.5 免疫组织化学法检测心肌组织MCP-1受体的表达 取大鼠心肌组织石蜡块，制作4 μm厚切片，常规脱蜡至水、抗原修复、封闭非特异性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、脱水、透明、中性树胶封片，具体按说明书进行。

2 结 果

2.1 Masson染色 Masson染色观察心肌组织胶原沉积，醛固酮组心肌细胞排列紊乱，细胞间质胶原蛋白明显沉积。详见图1。

正常对照组 醛固酮组

注：蓝色为胶原成分。

图1大鼠心肌细胞Masson染色(×40)

2.2 大鼠血清MCP-1表达和心脏/体重比的变化 醛固酮组血清MCP-1的表达和心脏/体重比明显高于正常组。详见表1。

表1 大鼠血清MCP-1含量和心脏/体重比的比较(±s)

与正常组比较，①P<0.05，②P<0.01。

2.3 大鼠心肌组织MCP-1 受体表达的变化 免疫组化染色显示，醛固酮组大鼠心肌组织MCP-1受体的表达明显高于正常组。详见图2。

正常对照组 醛固酮组

注：棕色为阳性表达。

图2大鼠心肌细胞MCP-1受体染色 (×100)

3 讨 论

心肌纤维化是高血压、心肌梗死及心肌病多种心血管疾病的终末期表现，其主要病理表现为心肌间质中成纤维细胞增殖，并转化为肌成纤维细胞及细胞外基质的过度沉积[1]。临床研究亦证实，醛固酮增多病人对比相同血压水平的原发性高血压病人，左心室肥厚及纤维化更明显，心血管疾病发生概率更高[6]。提示醛固酮致心肌纤维化作用是独立于高血压的。因此，醛固酮单独可引起血压升高和心脏病变，并且在不依赖高盐状态下是独立的心血管危险因素[4]。在正常盐饮食或高盐饮食状态下单纯给予醛固酮均可诱导心肌纤维化、心肌肥厚、炎性细胞浸润及炎症因子的表达[4-5，7]。外源性醛固酮还可诱导心肌成纤维细胞增殖，促进胶原蛋白合成[8]，而细胞增殖和细胞间质胶原蛋白的沉积是心血管纤维化过程中重要的病理条件。由此可见，醛固酮与心血管疾病密切相关，是重要的促纤维化物质，可能涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、NF-κB及转化生长因子-β(TGF-β)/Smads等信号通路[9-10]。

本课题组前期研究亦发现对正常盐饮食大鼠，采用外源性醛固酮干预6周后，大鼠心肌组织出现纤维化情况，组织学染色发现大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间质胶原蛋白明显沉积，并且心脏/体重比明显增加，提示心肌纤维化和心肌肥大，与国内学者研究[5]一致。同时，本研究发现醛固酮组大鼠血清MCP-1浓度明显上升高，同时心肌组织MCP-1受体的表达明显上调，提示醛固酮不仅可诱导心肌纤维化，还可促进大鼠体内炎症反应的发生，可能是一个独立的促炎症反应因子。

基础实验发现炎症因子如MCP-1表达与心肌梗死后心肌重构密切相关，炎症细胞浸润心肌组织如巨噬细胞、炎症因子分泌亦相应增多，促进α-平滑肌肌动蛋白及肌成纤维形成，引起心肌重构[11-12]，用加参方干预可抑制炎症因子表达，从而改善心肌重构。MCP-1是一种经典的炎症细胞趋化因子，与MCP-1受体结合后，可通过丝裂原活化蛋白激酶和PI3K-蛋白激酶B(AKT)等信号转导通路作用，激活多种炎症细胞如单核细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等，从而诱导各种炎症细胞迁移、聚集，并分泌各种炎症反应介质，如白介素、肿瘤坏死因子等，通过氧化应激等生物学效应，导致局部组织细胞增殖、胶原沉积等，并且炎症反应贯穿心血管重构的始终[13-14]。

本实验发现正常盐饮食状态下，单纯给予醛固酮不仅可导致心肌组织纤维化，还可上调机体MCP-1及其受体的表达，提示醛固酮亦是促炎因子，通过促进体内炎症反应可能是醛固酮致心肌纤维化的重要分子机制之一，这将为心肌纤维化的机制研究及防治提供新的思路和作用靶点。