超声辅助提取黄栌色素及其性能

任 云，尹芳芊，朱晓敏，王天星

（1.邯郸学院化学化工与材料学院，河北邯郸 056005；2.河北省杂环化合物重点实验室，河北邯郸 056005；3.邯郸市有机小分子重点实验室，河北邯郸 056005）

黄栌为漆树科黄栌属植物，乔木或灌木［1］。黄栌富含黄酮类化合物、单宁、多酚类物质及有机酸类等，还含有多种微量元素，例如钾、钠、铝、镁、硅、钙、磷［2］，其中最主要的成分是黄酮类。至今，从黄栌中共分离出18种黄酮类化合物，全棵不同地方的总黄酮量从大到小为根、枝茎、叶子［3］。除了黄酮类化合物外，周家永等［4］在研究黄栌化学成分时发现，黄栌的叶片、枝干和根茎中含有单宁及多酚类物质，且因黄栌产地和季节不同，其各个部位的单宁量也有很大差异。Westenburg等［5］在黄栌提取液中分离得到五没食子酰葡萄糖。黄栌嫩叶可以食用，叶片和枝干均可以入药，在我国民间，有高血压患者发现黄栌可明显降低血压［6］。枝干部位可提取色素作为染料，朱莉娜等［7］对黄栌色素提取及染色工艺进行了研究，得出超声波提取法乙醇作为溶剂效果最好。利用黄栌染液对真丝绸进行超声波染色，染色织物有一定的色牢度，媒染可提高染色真丝绸的耐皂洗色牢度。随着人们健康意识的提高，天然色素在日常生活中发挥着越来越重要的作用。在黄栌中提取的天然色素可应用在食品、印染、化妆品等行业。天然色素提取通常采用溶剂提取法，近年来，超声、微波等辅助手段可提高提取率，其中，超声辅助通过超声产生的搅拌和机械振动作用，破坏植物细胞的细胞壁以提高提取率，此过程没有化学反应，但可以缩短浸提时间或降低提取温度，能耗低、设备要求低［8-9］。

本文利用超声辅助溶剂提取法提取黄栌色素，并研究色素性能。

1 实验

1.1 试剂与仪器

试剂：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析纯，上海如吉生物科技发展有限公司），三氯化铁、氯化钙、氯化钠、氯化铝、无水硫酸铜、硫酸镁、硫酸锌（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司），氯化钾、抗坏血酸、铁氰化钾（分析纯，天津市光复科技发展有限公司），磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯，新乡市化学制剂厂）。

仪器：KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），T6紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），WK-600A高速药物粉碎机（青州市精诚机械有限公司），RE-52旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），PHS-3E pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），800型离心沉淀器（济南市医疗机械厂），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 超声辅助提取黄栌色素

将黄栌枝干截成小段，在65℃烘至绝干后粉碎至40目。称量黄栌枝干粉末1 g于锥形瓶中，加入20 mL 95%的乙醇溶液，在40℃、超声功率500 W的条件下提取30 min得到提取液。

1.3 实验设计［10］

由单因素实验考察各因素对黄栌色素提取的影响，包括超声功率、乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度。

在单因素实验的基础上，选取主要影响因素料液比、乙醇体积分数和提取温度，采用Box-Behnken设计响应面实验。以黄栌色素提取液吸光度为响应值，采用Design-Expert 8.0.6分析软件得到二次回归方程和误差分析，以确定优化工艺并进行验证。

1.4 测试

紫外可见光谱：将提取液以4 000 r/min离心10 min，取上清液适当稀释，在200～520 nm波长范围内进行扫描。

吸光度：将色素提取液离心10 min，取上清液稀释至0.1 g/L，在280 nm处测定。

提取率：准确称量黄栌枝干粉末20 g，按响应面法优化工艺提取。将浸提液离心后，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏后，70℃干燥至恒重，称量，计算黄栌色素提取率：

金属离子对色素稳定性的影响：将黄栌色素粉配制成1 mg/mL溶液；配制0.05 mol/L的CuSO4、KCl、CaCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、MgSO4溶液。取 1 mL色素溶液于25 mL容量瓶中，分别用8种金属盐溶液定容，在20℃下静置12 h后进行紫外可见光谱扫描，与原色素溶液比较最大吸收波长和吸收峰的变化，分析金属离子对色素稳定性的影响。

黄栌色素总还原力：配制黄栌色素和Vc溶液。取各溶液2.5 mL于25 mL锥形瓶中，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液2.5 mL、1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀，于50℃水浴保温20 min，快速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，摇匀后以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入1 g/L三氯化铁溶液2.5 mL，摇匀，在20℃下静置10 min，于700 nm处测定吸光度。

黄栌色素清除DPPH自由基：配制黄栌色素和Vc溶液，取各溶液5 mL，加入2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液5 mL，摇匀，在阴凉避光、20℃下静置30 min，在517 nm处测定吸光度A1；取各溶液5 mL，加入无水乙醇5 mL，在517 nm处测定吸光度A2；取5 mL DPPH溶液，加入5 mL蒸馏水，在517 nm处测定吸光度A0。按下式计算DPPH自由基清除率：

2 结果与讨论

2.1 紫外可见光谱

由图1可以看出，黄栌色素在280 nm处有最大吸收峰且稳定存在，因此确定黄栌色素的最大吸收波长为280 nm。

图1 黄栌色素的紫外可见吸收光谱

2.2 单因素实验

2.2.1 超声功率

由图2可知，超声辅助对提取过程有明显影响。随着超声功率的增大，黄栌色素提取液的吸光度近似线性增加，在达到最大功率500 W（由于设备硬件限制，最大超声功率为500 W）时吸光度最大。在后续实验过程中控制超声功率为500 W。

图2 超声功率对色素提取的影响

2.2.2 提取时间

由图3可知，随着提取时间的延长，黄栌色素的吸光度先增大后减小，在20 min时出现最大值（黄栌色素提取率最高）。因为在提取时间较短时，超声波产生的机械热效应和空化效应可以使黄栌色素被快速溶出；过度延长提取时间，可能会使色素重新被吸附，从而使吸光度减小。因此，后续实验固定超声提取时间为20 min。

图3 提取时间对色素提取的影响

2.2.3 乙醇体积分数

由图4可知，随着乙醇体积分数的增加，黄栌色素提取液的吸光度先增大后减小。在乙醇体积分数为60%时吸光度最大，说明此时色素提取率最高。由此可见，60%的乙醇溶液极性与黄栌色素的极性相近，色素更容易被提取出来。

图4 乙醇体积分数对色素提取的影响

2.2.4 料液比

一般情况下，随提取溶剂比例的增大，提取率逐渐增大，至最大值后趋于平缓或略有波动，说明提取物已充分提取。由图5可知，随着提取溶剂比例增加，吸光度先增大后减小，在料液比为1∶20时吸光度最大，之后吸光度减小，可能为正常实验波动，也可能是料液比为1∶20时，提取溶液体系的渗透压最适合色素析出。

图5 料液比对色素提取的影响

2.2.5 提取温度

由图6可知，随着提取温度的上升，色素吸光度先增大后减小，60℃时吸光度最大，温度太高不利于色素提取，因为温度太高，色素中的黄酮类化合物稳定性降低、结构被破坏，吸光度下降。因此，适宜的色素提取温度为60℃。

图6 提取温度对色素提取的影响

综上所述，超声功率与色素提取率近似成线性正相关，提取时间在20 min后，色素提取率可视为进入平台期，因此，两因素不作为响应面优化因素。遂以色素吸光度为响应值，对料液比、乙醇体积分数和提取温度进行响应面法优化实验。

2.3 响应面实验

2.3.1 建立二次回归方程及误差分析

对表1中的数据进行回归拟合得到二次回归方程为：吸光度=0.350+0.027A-9.875×10-3B+0.023C+1.000×10-3AB-0.011AC-0.011BC-0.012A2-0.018B2-0.055C2。

表1 响应面实验结果

通过ANOVA进行回归方程误差分析，结果如表2所示。

表2 响应面误差分析结果

由表2可知，该方程模型高度显著（P小于0.01），失拟误差不显著（P大于0.05）。CV值越小模型置信度越高，相关系数R2和Radj2越接近1，模型相关性越好。该模型的CV=3.59%、R2=0.969 5、Radj2=0.930 3。二次回归方程对实验的拟合程度较高，说明色素提取液响应值96.95%的影响来自于所考察的3因素，实验模型可以合理模拟实际实验，可以预测各因素、各水平下色素提取液的吸光度。另外，3因素中A、C、C2对色素提取液吸光度的影响高度显著；B、B2影响显著；AB、AC、BC、A2影响不显著，各因素影响从大到小依次为乙醇体积分数、提取温度、料液比。

2.3.2 各影响因素的交互作用

观察图7～9的响应面均比较平缓，对应等高线接近圆形，结合表2中3组交互作用P均大于0.05，表明3组交互作用均不显著。

由图7、图9可见，两图中三维响应面曲线沿料液比轴方向吸光度逐渐增加并趋于平缓，对应的三维响应面在底面的投影等高线沿料液比轴方向亦表现为吸光度逐渐增大并趋于平缓，没有起伏。说明提取液吸光度随提取液用量的增加逐渐增大，色素提取率增大；料液比1∶20附近为提取率最大点，色素已被充分提取，继续增加提取液用量，色素提取率不会提高。进而说明图5中吸光度在最大值后出现降低为正常实验波动。

图7 乙醇体积分数和料液比响应面曲线图

图8 乙醇体积分数和提取温度响应面曲线图

图9 料液比和提取温度响应面曲线图

根据响应面优化实验得出优化提取工艺为：乙醇体积分数68.03%、料液比1.00∶18.83、提取温度61.48℃。在此工艺条件下，20 g黄栌枝干粉末可提取色素粉1.48 g，提取率为7.4%。

2.4 色素性能

2.4.1 稳定性

由表3可知，Na+、K+、Ca2+、Mg2+对黄栌色素性能的影响极小，相对于原色素溶液的吸光度和最大吸收波长均无明显变化，故此4种金属离子对黄栌色素的稳定性无影响；Al3+使得黄栌色素的最大吸收波长红移了6 nm，且280、286 nm处的吸光度均有增加；Zn2+并未改变黄栌色素的最大吸收波长，但出现了黄色絮状沉淀，对黄栌色素稳定性有不利影响；Fe3+和Cu2+分别产生黑绿色沉淀和深绿色沉淀，故Fe3+和Cu2+对黄栌色素的稳定性有极不利的影响。综上所述，黄栌色素溶液可以接触 Na+、K+、Ca2+、Mg2+，根据实际情况可适当接触 Al3+，应避免接触 Zn2+、Fe3+和 Cu2+。

表3 金属离子对色素稳定性的影响

2.4.2 总还原力

黄栌色素和Vc通过自身的还原作用能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁，亚铁氰化钾与FeCl3反应，生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝，且吸光度越高，待测物的还原力越强。由图10可知，黄栌色素总还原力在所测质量浓度范围内大于Vc，具有较强的还原力。

图10 总还原力实验结果

2.4.3 DPPH自由基清除能力

黄栌色素自由基清除能力见图11。

图11 黄栌色素自由基清除能力

由图11可知，黄栌色素DPPH自由基清除率随色素质量浓度的升高而增大，但清除能力略低于Vc。反应后，DPPH迅速褪色为淡黄色透明溶液，且不同质量浓度的黄栌色素反应后溶液的吸光度有明显的梯度变化。在质量浓度达到0.18 mg/mL时，清除率可达92.3%，表明黄栌色素的自由基清除能力良好。

3 结论

（1）超声辅助溶剂提取工艺可较好地提取黄栌枝干中的色素。单因素实验结果表明：超声功率与提取率成线性关系；提取时间在20 min后可达平台期。响应面优化实验确定优化工艺条件为：乙醇体积分数68.03%、提取温度61.48℃、料液比1.00∶18.83。优化浸提条件下20 g黄栌枝干粉末可提取色素粉1.48 g，提取率为7.4%。

（2）Na+、K+、Ca2+、Mg2+对色素稳定性的影响很小；Al3+使黄栌色素的最大吸收波长红移了6 nm，吸光度增加；Zn2+、Fe3+和 Cu2+使色素产生沉淀。

（3）黄栌色素总还原力比Vc强，DPPH自由基清除能力比Vc弱，但在质量浓度达到0.18 mg/mL时，清除率可达92.3%。