当归补血汤干预肺纤维化大鼠气虚血瘀状态机制初探

王杰鹏，王少贤，方朝义，王 浩，方 芳，鲁辰希，刘 娜

肺纤维化(PF)是一种以慢性炎症和大量胶原纤维沉积为病理特点的肺间质疾病[1]，其发病原因和机制未明，且发病率和病死率逐年上升[2]。目前，该病尚缺乏特效药物，虽然尼达尼布和吡非尼酮可在一定程度上缓解患者临床症状，但其严重的不良反应和昂贵的价格限制了临床应用[3-4]。中医药在治疗PF中有着重要作用，不但能够缓解临床症状，还可改善患者服用激素和免疫抑制剂后出现的不良反应，有着广泛的应用前景，日益受到国内外学者的重视[5]。中医学认为，PF发病主要责之于肺气本虚，气虚无力运行血液而致瘀，故益气活血为PF的基本治法[6]。临床研究证实，PF患者不仅存在气虚证表现(如动则喘息气短)，也存在血瘀证表现(如口唇、爪甲紫绀等)[7]，而且患者血液呈现高血凝和高黏滞特点[8-9]。当归补血汤是益气活血的代表方，但其调节PF大鼠气虚血瘀状态的机制尚未明确。据此，本研究通过当归补血汤干预PF大鼠，观察大鼠体质量、负重游泳时间、血液流变学及气虚血瘀证候量化评分的变化，初步探讨当归补血汤干预PF大鼠气虚血瘀状态的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠90只，体质量180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK(京)2016-0006，饲养于清洁级动物房。

1.2实验试剂与仪器 注射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社，批号：970592)。黄芪、当归中药饮片由北京同仁堂有限责任公司提供。全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司，型号：LBY-N75008)，组织包埋机(德国徕卡，型号：EG11508)，全自动轮转式切片机(德国徕卡，型号：RM2255)，摊片机(德国徕卡，型号：HI1210)，光学显微镜(日本奥林巴斯，型号：BX53)。

1.3方法

1.3.1造模与分组给药：90只SD大鼠适应性饲养1周后，称重，根据体质量编号，随机分为假手术组、模型组和当归补血汤组，每组30只。依据文献[10]的方法，模型组和当归补血汤组采用气管内滴注盐酸博莱霉素制备PF大鼠模型。手术后第2天起灌胃治疗，假手术组和模型组予以生理盐水10 ml/(kg·d)灌胃，当归补血汤组灌胃当归补血汤(由黄芪30 g、当归6 g组成)中药煎液3.75 g/(kg·d)。

1.3.2标本采集：分别于灌胃治疗后第7、14和28天分3次以2%戊巴比妥钠(4 mg/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，每次10只，断头取血、取肺，左肺组织置于预冷生理盐水中快速冲洗，剪取大小为1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的组织块，置入4%多聚甲醛溶液中固定。采集血标本2 ml置于提前加入0.1 ml EDTA的采血管中。

1.3.3大鼠体质量变化：于手术前1 d每组随机选取10只大鼠称取大鼠体质量，作为第0天体质量。分别于灌胃后第7、14和28天分别称取10只大鼠体质量，观察体质量变化。

1.3.4大鼠肺组织病理形态学观察：取第28天时以4%多聚甲醛固定的肺组织，经脱水、透明后进行石蜡包埋，自动切片机切取厚度为0.4 μm的组织切片，行HE染色和Masson染色，观察大鼠肺组织炎症浸润和胶原沉积情况。

1.3.5大鼠负重游泳时间测定：分别于实验第7、14和28天将大鼠置于水箱中游泳，水温25℃，尾部负重相当于体质量10%的铅皮，游泳直至力竭(头顶没入水面，沉入水中8 s不能浮起)，记录时间。

1.3.6血液流变学检测：取抗凝的全血标本，置于全自动血液流变仪检测大鼠全血黏度(低切、中切和高切)变化。

1.3.7大鼠气虚血瘀证候量化评分：依据文献[11-12]，参照2002年出版《中药新药临床指导原则(试行)》中血瘀证部分和气虚证部分的症状分级量化评分表，对大鼠进行气虚血瘀证候量化评分。评分表见表1。

表1 大鼠气虚血瘀证候量化评分表

2 结果

2.1大鼠体质量变化情况 3组在第0天的体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组在第7、14和28天的体质量显著下降(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，当归补血汤组在第14和28天的体质量显著升高(P<0.05)。当归补血汤组在第7天的体质量虽有升高，但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2大鼠肺组织病理形态学改变 HE染色和Masson染色结果显示，假手术组大鼠的肺组织结构完整，无炎性细胞浸润，无纤维细胞增殖。模型组大鼠的肺组织肺间质融合，结构破坏，伴大量胶原及成纤维细胞沉积。表明PF大鼠模型造模成功。见图1和图2。

表2 3组大鼠的体质量变化情况

注：与假手术组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05

图1 假手术组和模型组肺组织的HE染色结果(HE ×20)

图2 假手术组和模型组肺组织的Masson染色结果(Masson ×20)

2.3大鼠负重游泳时间比较 与假手术组比较，模型组在第7、14和28天的负重游泳时间均显著下降(P<0.01)。与模型组比较，当归补血汤组在第7、14和28天的负重游泳时间均显著升高(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 3组大鼠的负重游泳时间比较

注：与假手术组比较，bP<0.01；与模型组比较，aP<0.05，dP<0.01

2.4大鼠血液流变学指标比较 与假手术组比较，模型组大鼠在第7、14和28天的全血黏度(低切、中切和高切)均显著升高(P<0.01)。与模型组比较，当归补血汤组在第7、14和28天的全血黏度(低切、中切和高切)均显著下降(P<0.05或P<0.01)。见表4。

2.5大鼠气虚血瘀证候量化评分比较 与假手术组比较，模型组在第7、14和28天的气虚血瘀证候量化评分显著升高(P<0.01)。与模型组比较，当归补血汤组在第7、14和28天的虚血瘀证候量化评分显著下降(P<0.05或P<0.01)。见表5。

3 讨论

有相关研究显示，气虚血瘀是PF常见的证候特征，益气活血是该病的基本治法[13]。对于其形成机制，李丽娜等[14]从气血角度进行了阐述，认为气血本出一源，其形成和运行均与肺有密切的关系。在PF状态下，机体的免疫失衡与肺气虚证的免疫系统变化一致。另外，肺毛细血管出现广泛狭窄和(或)闭塞、微血栓形成导致循环阻力增加、微循环速度降低等表现符合中医血瘀证的微观表现，使组织细胞无法从血液中获得营养物质(如葡萄糖、氨基酸等)。炎性细胞浸润和胶原沉积是PF形成的重要病理改变。本研究结果显示，PF模型大鼠肺组织存在大量炎性细胞浸润和成纤维细胞增殖，肺间质增厚。以上病理改变致使肺部气体交换受阻，细胞处于缺氧状态。缺氧和葡萄糖缺乏导致细胞能量代谢障碍，影响支气管肺泡干细胞的功能，致使肺组织修复障碍，血管新生水平降低，血管退化，符合气虚血瘀证的变化情况[15-17]。

表4 3组大鼠血液流变学指标比较

注：与假手术组比较，bP<0.01；与模型组比较，aP<0.05，dP<0.01

表5 3组大鼠气虚血瘀证候量化评分比较分)

注：与假手术组比较，bP<0.01；与模型组比较，aP<0.05，dP<0.01

游泳力竭时间是反映运动耐力的重要指标[18]，机体在气虚状态下存在耐力下降的表现，故负重游泳实验可用于评价机体的气虚状态[19]。血液流变学指标可反映血液及其有形成分的流动性、变形性和聚集性变化。低切变率下的全血黏度反映红细胞聚集性，低切黏度高，红细胞聚集性高；高切变率下全血黏度反映红细胞变形性，高切黏度高，则红细胞变形能力或弹性差[20]。本研究结果提示，PF大鼠负重游泳时间较假手术组显著下降，全血黏度(中切、低切和高切)较假手术组显著升高。表明PF大鼠存在气虚状态，且红细胞聚集性升高，变形能力或弹性变差，导致血液黏度升高。究其原因，一方面可能是气虚无力推动血液运行，而致血液凝滞，出现高凝状态；另一方面可能是瘀血阻滞肺络，肺失宣降，与外界气体交换受阻，导致机体能量代谢障碍，加重了气虚状态。

根据上述，益气活血法是临床上治疗PF的基本方法。当归补血汤源自《内外伤辨惑论》，由黄芪和当归以5∶1的比例组成，具有益气活血之功效。有实验研究显示，当归补血汤可改善纤维化肺脏局部免疫环境，并能改善PF小鼠的肺毛细血管瘀血状况[14]。本研究结果提示，当归补血汤可提高PF大鼠负重游泳时间和体质量，下调大鼠红细胞聚集性，改善其变形能力和弹性，从而减轻大鼠肺组织肺络瘀阻的现象。其机制可能是通过补益肺气，进而推动血液运行，延缓或减轻肺络瘀血，增加机体与外界气体的交换，改善缺氧和葡萄糖缺乏导致的细胞能量代谢障碍，促进肺组织局部微环境的修复，从而通过益气活血作用影响PF病理进程，缓解其气虚血瘀状态。

综上所述，气虚血瘀是PF疾病过程的基本病机，当归补血汤能够提高PF大鼠耐力，下调全血黏度，并降低气虚血瘀证候量化评分，但其具体机制尚待深入研究。