大豆苷元对人成骨样MG-63细胞分化的影响及其分子机制研究

高丹丹，张玲玲，陈家乐，崔欢欢，温晓昶，王 越，金 鑫

随着我国人口老龄化的日渐加重，骨质疏松症(osteoporosis, OP)作为最常见的骨骼疾病，已成为困扰老年人健康的重大疾病，尤其多见于绝经后女性[1-2]。目前，在临床上治疗绝经后OP首选雌激素替代疗法。虽然应用雌激素能有效防止骨量减少，从而降低骨折发生率，但长期大量使用外源性雌激素会增加心血管事件、子宫内膜癌、血栓栓塞和乳腺癌的发病风险[3-5]。因此，研发不良反应小的抗绝经后OP药物，已成为当前研究的热点和难点。

植物雌激素是一类与雌激素有着类似化学结构，并且能与雌激素受体(estrogen receptor, ER)结合的天然化合物，具有与雌激素相似的作用[6]。大豆异黄酮具有耐受性好、不良反应少等优点，被认为是预防和治疗绝经后OP的潜在药物，近年来备受人们的关注[7]。大豆苷元是大豆异黄酮中主要的活性成分之一，因具有与雌激素类似的母核结构，所以具有类雌激素样作用[8]。有相关研究表明，大豆苷元不仅能够影响成骨细胞的形成，也影响破骨细胞的吸收[9-10]，且对绝经后OP具有预防和治疗作用，但是其分子作用机制还不太明确。本研究以人成骨样MG-63细胞为研究对象，该细胞具备特征性成骨细胞功能，兼表达ERα和ERβ雌激素受体亚型[11]，观察大豆苷元对人成骨细胞分化的作用及其分子机制。本研究旨在进一步揭示大豆苷元对骨形成的影响及其分子作用机制，为临床应用植物雌激素治疗绝经后OP提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂 大豆苷元(纯度>98%)购自中国北京药品生物制品检定所；DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国gibco公司；l7β-雌二醇和ICI 182,780购自美国sigma公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；人Ⅰ型胶原ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞株和细胞培养：人成骨样MG-63细胞系为美国ATCC公司产品，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。用含10% FBS的DMEM高糖培养液培养，培养液中加入链霉素100 μg/ml和青霉素100 U/ml，置于5% CO2，37℃培养箱中培养，2 d更换1次培养液，培养3～4 d进行1次传代。

1.2.2细胞分组：取对数生长期的MG-63细胞密度为4×104/ml，接种于12孔板中，5% CO2，37℃培养箱中培养24 h后，更换含有1% FBS的无酚红DMEM高糖培养基继续培养24 h。然后将细胞分为对照组、雌二醇组、低、中和高浓度组，其中低、中和高浓度组分别加入0.01、0.1和1.0 μmol/L大豆苷元处理，雌二醇组加入0.1 μmol/L雌二醇处理，对照组不做任何处理。每个药物浓度设立3个副孔，置于5% CO2,37℃培养箱分别培养2、4和6 d。

1.2.3比色法检测ALP活性：各组细胞培养结束后，用PBS漂洗3次，将液体吸干净，加入配制好的0.1% Triton X-100，每孔500 μl，作用3 min，用移液器充分吹打，收集至1.5 ml Ependorf管中，超声波细胞粉碎仪破碎后，1500 r/min离心10 min，取上清液作为ALP活性测定的标本，参考试剂盒说明书检测细胞上清液中ALP的活性。

1.2.4ELISA法检测Ⅰ型胶原的含量：在不同的时间点收集细胞培养上清，根据试剂盒说明书进行操作测定细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白的含量。取100 μl样品或标准品加入孔中，加入检测抗体并在37℃下孵育1 h。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体，孵育1 h。再加入TMB底物显色剂，混匀后观察颜色变化，最后加入终止液。立即读取490 nm处的吸光度，并根据标准曲线计算Ⅰ型胶原分泌量。

1.2.5ER拮抗剂阻断实验：取对数生长期的MG-63细胞接种于12孔板中，密度为4×104/ml，5% CO2，37℃培养箱中培养24 h后，更换含有1% FBS的无酚红DMEM高糖培养基继续培养24 h。然后将细胞分为对照组、ICI组、大豆苷元组和大豆苷元+ICI组。其中大豆苷元+ICI组在药物处理前先加入ICI 182,780(ERα以及ERβ拮抗剂)100 μmol/L，作用30 min，然后再加入大豆苷元作用最明显的剂量0.1 μmol/L，ICI组和大豆苷元组分别加入100 μmol/L ICI 182,780和0.1 μmol/L大豆苷元处理，对照组不做任何处理。测定各组ALP和Ⅰ型胶原的分泌量。

1.2.6细胞转染：利用脂质体法将pGenesil-ERα shRNA、pGenesil-ERβ shRNA、pGenesil-scrambled shRNA分别转染至人成骨样MG-63细胞中，按照参考文献[12]所述，构建稳定转染的MG-63/ERα shRNA、MG-63/ERβ shRNA和MG-63/scrambled shRNA细胞。将上述稳定转染的细胞和未转染MG-63细胞均分为对照组、大豆苷元组和雌二醇组，其中大豆苷元组加入0.1 μmol/L大豆苷元处理，雌二醇组加入0.1 μmol/L雌二醇处理，对照组不做任何处理。测定各组ALP和Ⅰ型胶原的分泌量。

2 结果

2.1大豆苷元通过增强ALP活性促进人成骨样MG-63细胞分化成熟 用不同浓度的大豆苷元或雌二醇处理人成骨样MG-63细胞2、4或6 d，分别测定细胞中ALP活性。研究结果显示，大豆苷元和雌二醇均以时间依赖性的增强细胞中ALP的活性。与对照组比较，中、高浓度组和雌二醇组在培养4和6 d时可显著增强细胞内的ALP活性(P<0.05)，而低浓度组只有在培养6 d时才显著增强细胞内的ALP活性(P<0.05)。见图1。

图1 不同浓度的大豆苷元对人成骨样MG-63细胞ALP活性的影响

低、中和高浓度组分别加入0.01、0.1和1.0 μmol/L大豆苷元处理，雌二醇组加入0.1 μmol/L雌二醇处理，对照组不做任何处理；ALP为碱性磷酸酶

2.2大豆苷元通过增加Ⅰ型胶原分泌促进人成骨样MG-63细胞分化成熟 用不同浓度的大豆苷元或雌二醇处理人成骨样MG-63细胞2、4或6 d，分别测定细胞分泌的Ⅰ型胶原。研究结果显示，与对照组比较，中、高浓度组和雌二醇组在培养4和6 d时能显著提高Ⅰ型胶原的分泌(P<0.05)，而低浓度组只有在培养6 d时能提高Ⅰ型胶原的分泌(P<0.05)。见图2。

图2 不同浓度的大豆苷元对人成骨样MG-63细胞Ⅰ型胶原分泌的影响

低、中和高浓度组分别加入0.01、0.1和1.0 μmol/L大豆苷元处理，雌二醇组加入0.1 μmol/L雌二醇处理，对照组不做任何处理

2.3ER阻断剂对大豆苷元促人成骨样MG-63细胞分化的阻断作用 研究结果显示，与对照组比较，大豆苷元组细胞中ALP活性及Ⅰ型胶原分泌量明显增加(P<0.05)，而ICI组细胞中ALP的活性和Ⅰ型胶原分泌量并无显著变化(P>0.05)。与大豆苷元组比较，大豆苷元+ICI组细胞中ALP活性及Ⅰ型胶原分泌量明显下降(P<0.05)。见图3。

图3 ER阻断剂对大豆苷元诱导人成骨样MG-63细胞中ALP活性和Ⅰ型胶原分泌量的影响

大豆苷元+ICI组应用100 μmol/L ICI 182,780以及0.1 μmol/L大豆苷元处理，ICI组和大豆苷元组分别应用100 μmol/L ICI 182,780和0.1 μmol/L大豆苷元处理，对照组不做任何处理；ALP为碱性磷酸酶；与对照组比较，aP<0.05；与大豆苷元组比较，cP<0.05

2.4大豆苷元对人成骨样MG-63细胞促分化作用由ERα和ERβ共同介导 应用大豆苷元或雌二醇处理未转染及稳定转染的MG-63细胞，随后应用比色法和ELISA法分别检测上述MG-63细胞ALP活性和Ⅰ型胶原的分泌量。研究结果显示，雌二醇对MG-63/scrambled shRNA细胞ALP活性和Ⅰ型胶原分泌的促进作用较未转染MG-63细胞差异无统计学意义(P>0.05)，对MG-63/ERα shRNA细胞ALP活性和Ⅰ型胶原分泌的促进作用则较MG-63/scrambled shRNA和未转染MG-63细胞明显减弱(P<0.05)，而对MG-63/ERβ shRNA细胞的作用影响不大(P>0.05)。大豆苷元对上述细胞ALP活性和Ⅰ型胶原分泌的促进作用无显著差异(P>0.05)。见图4。

图4 大豆苷元对MG-63/ERα shRNA和MG-63/ERβ shRNA细胞ALP活性和Ⅰ型胶原分泌的影响

大豆苷元组加入0.1 μmol/L大豆苷元处理，雌二醇组加入0.1 μmol/L雌二醇处理，对照组不做任何处理；ALP为碱性磷酸酶；与未转染MG-63细胞比较，aP<0.05

3 讨论

OP是一种渐进性、系统性疾病，表现为骨量减少、骨微观结构退行性病变，患者多见于绝经后女性和老年男性[13-14]。绝经后OP是由于卵巢功能衰退，雌激素缺乏，导致骨量减少，骨组织结构发生变化，使骨脆性增加、易发生骨折[15-16]。有研究证实，黄酮类化合物能显著促进骨的形成，探讨其对成骨机制的研究已成为当今热点之一[17]。大豆苷元为异黄酮类化合物，是一种与雌激素结构相似的植物雌激素。相关研究表明，提高异黄酮的摄入量可使大鼠骨密度上升，可预防因雌激素缺乏引起OP的发生[18]。人体ER有2种亚型分别为ERα和ERβ，存在于成骨细胞、破骨细胞及其前体细胞上，雌激素通过合并激活2种受体发挥骨保护作用[19]。因此，本研究选择兼有2种ER表达的人成骨样MG-63细胞为研究对象，研究大豆苷元对成骨细胞分化作用的影响，探讨其与ER相关的分子机制。

本研究通过测定成骨细胞分化的2个重要标志即ALP活性和Ⅰ型胶原含量，评价大豆苷元对成骨细胞分化功能的影响。ALP属于同源二聚体蛋白，对其活性的检测是评价成骨细胞分化功能常见的方法之一，Ⅰ型胶原则是另一种检测成骨细胞分化成熟的标志。从实验结果中可得知，0.1～1.0 μmol/L的剂量范围内，大豆苷元以剂量依赖的方式增强了人成骨样MG-63细胞中ALP的活性和Ⅰ型胶原的含量，但大豆苷元在等浓度的条件下对ALP活性和Ⅰ型胶原分泌的促进作用要明显弱于雌二醇。提示大豆苷元能通过增强ALP活性,提高Ⅰ型胶原分泌促进人成骨样MG-63细胞分化成熟。先前的研究结果显示，雌酚酮、雌酚酮-大黄酸混合物、雌二醇及葛根素均能促进人成骨样MG-63细胞分化[20-21]；此外Qu等[22]研究发现，雌二醇和雷洛昔芬在人成骨细胞系hFOB、原代小鼠成骨细胞或骨髓培养物中增强了ALP和Ⅰ型胶原蛋白表达，上述报道与本次实验结果基本一致。然而，也有报道较高浓度的异黄酮类化合物染料木素显示出显著的抑制作用，雷洛昔芬对ALP没有影响。Davis等[23]报道结果显示，细胞密度、雌二醇、血清等多种因素能够影响大鼠成骨样细胞系ROS 17/2.8和UMR-106-01的ER水平，可能导致ER的丰度波动，以诱导雌激素反应性，这些因素可能造成雌激素类物质对成骨细胞分化的测定结果不一致。

为了揭示大豆苷元对人成骨样MG-63细胞分化的潜在分子机制，本研究使用ICI 182,780进行阻断，结果表明ER拮抗剂ICI 182,780能够抑制大豆苷元增强人成骨样MG-63细胞ALP活性和促进Ⅰ型胶原蛋白分泌的作用。表明大豆苷元对人成骨样MG-63细胞分化的影响主要由ER途径介导。应用小RNA干扰技术进行脂质体转染实验，实验结果进一步证明了大豆苷元对人成骨样MG-63细胞的影响主要由ERα和ERβ共同介导。Rickard等[24]研究发现，异黄酮类化合物染料木黄酮在人成骨细胞中发挥出弱雌激素样作用也是由ERα和ERβ介导的；而Liao等[25]的实验研究发现，染料木黄酮影响成骨细胞相关分化基因，只通过活化ERα基因的表达。推断这些差异反应可能是由于以下几种因素，如培养条件、细胞种类差异、分化程度以及不同细胞系和原代培养物中的各种ER含量等，上述结果还需要通过进一步的研究来证明。

综上所述，大豆苷元可通过ER介导增强人成骨样MG-63细胞中ALP活性，并促进Ⅰ型胶原的分泌，本实验结果为大豆苷元进一步应用于临床治疗绝经后OP提供理论基础。