RASSF1A基因甲基化及血浆MYC抗体在宫颈癌诊断中的价值

程晓春 周 欣 李 晖 周涛琪 庞林荣 陈 俊

宁波市鄞州人民医院(315040)

宫颈癌是女性常见的一种恶性肿瘤[1]。据世界卫生组织统计，全球每年有53万新增病例，其中发展中国家占80%[2]。早期诊断、早期治疗是降低宫颈癌死亡率的关键[3]。寻找有效检测指标对早期宫颈癌筛查具有重要意义。张娴等[4]研究表明，RA相关区域家族1A(RASSF1A)抑癌基因启动子甲基化是导致抑癌基因失活的生物学机制之一，在宫颈癌发生的早期具有重要作用。骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同源物(MYC)抗体与宫颈癌的发生发展相关，有一定诊断价值[5]。本研究探讨了RASSF1A基因甲基化及血浆MYC抗体在宫颈癌诊断中的价值，以期为临床诊断提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2017年1月-2018年6月本院收治的宫颈癌患者64例(宫颈癌组)。纳入标准：①符合宫颈癌诊断标准[6]；②经阴道镜检查及病理组织学检查确诊；③首次接受抗癌治疗；④患者均已签署知情同意书。排除标准：①有系统性红斑狼疮、原发性血小板紫癜、类风湿性关节炎等自身免疫系统疾病；②有宫颈炎症等其他宫颈疾病；③合并其他恶性肿瘤。同期选取健康体检女性45例作为对照组。本研究经本院伦理委员会审批，研究对象均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1样本采集与保存分别于宫颈癌患者及健康女性清晨空腹采集肘静脉血抗凝，室温静置片刻后离心分离血浆，-70℃保存待测。

1.2.2RASSF1A基因甲基化检测采用DNA提取试剂盒提取血浆中游离DNA，采用甲基化试剂盒将DNA中的胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应，使胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不改变。采用巢式甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒扩增RASSF1A基因，RASSF1A基因PCR扩增引物序列见表1。PCR反应体系为25μl，PCR反应条件为：95℃：10min；95℃：45s；64℃(RASSF1A-M引物退火温度)或59℃(RASSF1A-U引物退火温度)：45s；72℃：60s，共40个循环。以等量去离子水作为对照组，用经甲基转移酶处理的正常外周血淋巴细胞DNA作为甲基化阳性对照，未经处理的外周血淋巴细胞DNA作为未甲基化阳性对照。凝胶成像系统下观察结果并图像分析。血浆DNA提取试剂盒购自艾美捷科技有限公司，ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit甲基化试剂盒购自上海复申生物科技有限公司，巢式甲基化特异性PCR扩增试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司，RASSF1A基因的引物由Invitrogen公司设计并构建。

表1 RASSF1A基因PCR扩增引物序列

1.2.3MYC抗体水平检测双抗体夹心酶联免疫吸附实验法检测血浆MYC抗体水平，检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司，在全自动酶标仪450 nm波长处测定OD值，计算出样品中抗原与抗体的特异结合指数，即血浆MYC抗体水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组对象RASSF1A基因甲基化状态

宫颈癌组年龄(48.8±17.2)岁(30～60岁)，对照组年龄(49.4±18.3)岁(30～60岁)，两组年龄无差异(P>0.05)。血浆RASSF1A基因甲基化状态检测，宫颈癌组RASSF1A基因甲基化31例(48.4%)，而对照组45例均未检测出，两组RASSF1A基因甲基化存在差异(χ2=28.126，P=0.000)。宫颈癌组样本电泳图见图1。

2.2 两组对象血浆MYC抗体水平

宫颈癌组血浆MYC抗体(1.54±0.26)水平高于对照组(1.23±0.22)(t= 6.521，P=0.000)。

2.3 RASSF1A基因甲基化状态及MYC抗体水平与临床特征关系

经分析， RASSF1A基因甲基化状态与患者临床分期及淋巴结转移存在差异(P<0.05)，而与患者年龄、病理类型、病理分级及肿瘤直径等未见差异(P>0.05)。以宫颈癌患者血浆中MYC抗体水平均值为分界线，高于平均值为高表达，低于平均值为低表达。宫颈癌患者不同血浆MYC抗体表达与临床分期及肿瘤直径存在差异(P<0.05)，而与患者年龄、病理类型、病理分级及淋巴结转移等未见差异(P>0.05)。见表2。

(A：甲基化 B：非甲基化 C：不完全甲基化)图1 RASSF1A基因甲基化凝胶电泳图

表2 宫颈癌患者临床特征与RASSF1A基因甲基化及MYC抗体表达[例(%)]

2.4 血浆MYC抗体水平对宫颈癌的诊断价值

血浆MYC抗体水平诊断宫颈癌的曲线下面积为0.611，诊断分界点为1.32，其敏感度为35.9%，特异度为84.4%，见图2。

图2 ROC曲线分析血浆MYC抗体水平对宫颈癌的诊断价值

3 讨论

近年来我国宫颈癌的发病率不断上升[7]。宫颈癌疾病的进展过程表现为从低级别的癌前上皮内瘤形成到宫颈癌早期浸润癌、浸润癌阶段[8]。早期诊断率及时采取相应治疗措施，能够大大提高宫颈癌患者的生存机率[9]。

RASSF1A基因是近年新发现的一种抑癌基因，定位于人类第3号染色体(3q21.3)上[10]。在正常组织中大量表达，但在肿瘤疾病中由于发生甲基化可导致该基因转录失活，与肿瘤发生发展密切相关[11]。叶婷等[12]研究表明，RASSF1A基因甲基化检测可在肝癌、非小细胞癌等多种疾病发生的早期诊断中发挥作用。刘杰麟等[13]研究表明，结直肠癌患者肿瘤组织中RASSF1A基因启动子甲基化率显著高于癌旁组织，可能在结直肠癌疾病发生早期起作用，与结直肠癌发展有关。本研究结果显示，48.4%宫颈癌患者发现RASSF1A基因启动子呈甲基化状态，而健康女性均未检测出，提示RASSF1A基因甲基化可能与宫颈癌发生有关，检测RASSF1A基因甲基化状态可能对诊断宫颈癌有一定价值。本研究中RASSF1A基因甲基化状态与患者临床分期及淋巴结转移有关，提示ASSF1A基因甲基化可能与宫颈癌疾病严重程度有关。

MYC是一组编码核蛋白的原癌基因，定位于人类第8号染色体(8q24)上，与细胞增殖、生长、分化密切相关[14]。Kuglik等[15]研究表明，MYC基因异常表达在宫颈癌细胞中的发生频率显著高于癌前病变细胞，可能与宫颈癌疾病的发生发展有关。本研究结果显示，宫颈癌组患者血浆MYC抗体水平显著高于对照组，提示血浆MYC抗体水平增高可能与宫颈癌疾病发生有关。胡茜等[16]研究表明，c-Myc蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率显著高于正常对照组，且c-Myc水平与肿瘤组织病理分化及临床分期相关。本研究结果血浆MYC抗体水平与患者临床分期及肿瘤直径有关。

麦丽萍等[5]研究表明MYC抗体检测宫颈癌的曲线下面积为0.662，敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别8.14%、89.64%、44.65%及49.52%。本研究诊断宫颈癌的曲线下面积为0.799，诊断分界点为1.32，敏感度为35.9%，特异度为84.4%。RASSF1A基因甲基化和血浆MYC抗体检测对宫颈癌诊断有一定辅助价值。由于本研究纳入样本量少，后期将扩大样本继续深入研究，为宫颈癌的临床诊治寻找新指标。