IVF-ET术后妊娠早期绒毛膜下血肿与NK细胞及其表面分子CD49d、CD11b的关系

陈 洋 陈 莉 龙 伟 许 科

南京医科大学附属常州市妇幼保健院(213000)

绒毛膜下血肿(SCH)是指妊娠早期母胎界面的绒毛膜板与底蜕膜分离出血，随着积聚的血液增多，血肿也逐渐形成[1]。自然妊娠早期合并绒毛膜下血肿时易出现母体及胎儿异常[2]，而经体外受精胚胎移植(IVF-ET)术助孕后SCH的发生率显著高于自然妊娠[3]。原因尚不完全明确，目前认为可能与妊娠早期自然杀伤细胞数量的改变有关。妊娠早期子宫蜕膜组织发生自然杀伤细胞即子宫自然杀伤(uNK)细胞显著增加。现普遍认为，uNK 细胞是由外周血中的自然杀伤细胞(pNK)中的CD56+16-NK亚群募集而来，因此若IVF-ET伴有SCH的患者外周血中该细胞亚群数量明显变化，则可以推测两者间可能关系。本研究首先通过测定伴有SCH的IVF-ET患者与不伴有SCH的IVF-ET患者的外周血，评估两者之间细胞亚群的差异。另有文献[4]指出， CD56+16-NK细胞可能在uNK的募集过程中扮演着重要角色。同时，黏附分子家族的整合素α4(CD49d) 及整合素αm(CD11b)亦被证实参与了uNK的募集，并发挥着重要作用[5]。因此二者的表达量是否与细胞亚群的表达存在直接的相关性，进而在一定程度上成为预测CD56+16-NK亚群数量的特异性指标，亦是本文探讨的重点。本文讨论IVF-ET术后临床妊娠孕早期超声提示合并绒毛膜下血肿的患者与未合并绒毛膜下血肿的患者外周血淋巴细胞中CD56+16+NK细胞和CD56+16-NK的细胞的数量，以及两种亚型的NK细胞表面的整合素分子CD49d和CD11b的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年2月-2019年12月于本院生殖中心行IVF-ET术助孕后临床妊娠者41例为研究对象，年龄(21～35)岁，孕龄(6～11)周，其中伴有绒毛膜下血肿20例为观察组，未合并绒毛膜下血肿21例为对照组。纳入标准：IVF-ET术后妊娠早期经超声检查均可见宫内妊娠。排除标准：①复发性流产；②宫颈机能不全；③子宫肌瘤、子宫发育异常；④合并严重心、肝、脾、肺、肾等重要脏器病变；⑤严重内分泌疾病。本研究通过本院伦理委员会审查，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 检测方法

采集患者空腹静脉血采用流式细胞术检测。选取采血时间<2 h的无菌抗凝外周静脉血50 ul，按照以下分组：①空白对照；②CD16-FITC+CD56-PE-Cy5；③CD16- FITC+CD56-PE-Cy5+CD49d-PE；④CD16-FITC+CD56-PE-Cy5+CD11b-PE，抗体均购自BD公司。按分组分别加入抗体5μl，避光，室温孵育30min。加入1 ml红细胞裂解液(BD公司)，避光37℃10min后300g离心10min，弃上清加入1ml PBS，混匀后离心10min，弃上清，每管加入200 μl PBS，混匀，15min内采用BD FACS Calibur流式细胞仪完成检测。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般情况比较

观察组与对照组年龄(30.3±3.3岁、29.2±2.8岁)及孕周(7.6±1.1周、7.3±0.9周)无差异(P>0.05)。

2.2 外周血淋巴细胞中 CD56+CD16+NK细胞、CD56+16-NK细胞占比

外周血中CD56+CD16+NK细胞、CD56+16-NK细胞占比观察组与对照组无差异(P>0.05)。但两组CD56+16-NK细胞占比均低于CD56+CD16+NK细胞。见表1。

表1 两组外周血淋巴两种NK细胞亚群细胞中占比比较(%)

2.3 CD56+CD16+NK细胞、CD56+16-NK细胞表面CD11b表达

CD11b在观察组CD56+CD16+NK细胞、CD56+16-NK细胞表面占比均低于对照组(P<0.05)，见图1、图2(1722页)和表2。

表2 两组NK细胞亚型表面CD11b表达占比比较(%)

2.4 CD56+CD16+NK、CD56+16-NK细胞表面CD49d表达

CD49d在观察组CD56+CD16+NK细胞、CD56+16-NK细胞表面占比与对照组无差异(P>0.05)，见图3、图4(1722页)和表3。

表3 两组NK细胞亚型表面CD49d表达占比比较(%)

3 讨论

SCH是妊娠早期患者行超声检查中常见的一种临床现象，在IVF助孕妊娠患者中发病率较高，但目前对此类临床现象发生原因探讨较少。妊娠由多种淋巴免疫细胞及多种细胞因子共同参与完成。早孕期，雌孕激素水平较高，刺激外周血中的pNK迅速转移于母胎界面，转化为蜕膜化uNK细胞，后者随着孕周的增加而减少[6]。多数学者认为，uNK 细胞对妊娠的作用主要为促进母胎界面的血流增加、调节滋养细胞的侵袭作用和促进母胎界面的免疫耐受。有学者报道SCH通过影响滋养层细胞侵袭子宫内膜过程导致妊娠期并发症的发生[7-8]。Tuckerman 等[9]强调，着床内膜的局部NK细胞数量和活性可能受到植入的胚胎调控。本文探究IVF妊娠患者出现SCH与NK细胞水平及表面整合素分子的相关关系。

鉴于妊娠期子宫蜕膜组织无法获得，而子宫蜕膜局部NK细胞可以通过外周血NK细胞水平反映[10]。故本研究仅检测了患者外周血NK细胞水平。妊娠早期，子宫NK细胞源性的大颗粒淋巴细胞，即uNK细胞，主要表型为CD56+CD16-，占淋巴细胞总量的70%～80%。而外周血pNK细胞主要为CD56+CD16+表型[11]。虽然本研究中的样本为外周血，但仍将CD56+CD16+NK细胞和CD56+CD16-NK细胞同时作为检测指标便于验证。目前研究普遍认为，uNK是由pNK细胞中的CD56+ CD16-亚群在一系列趋化因子和黏附分子作用下从外周血中募集至妊娠子宫分化而来[12]。

整合素由α、β两个亚基组成参与了炎症反应中NK细胞与血管内皮细胞结合以及NK细胞外渗募集的调控[13]。研究显示，β2亚基与整合素αm(CD11b)结合，促进NK细胞与血管内皮细胞的结合及跨内皮细胞的结合及跨内皮转运，参与细胞-细胞间的黏附反应。Santoni等[14]研究提示外周血NK细胞募集至子宫的过程亦可能受到其调控。整合素α4(CD49d)，表达于pNK细胞表面，可参与NK细胞与血管内皮黏附的调控，通过抗体阻断影响大鼠uNK细胞的数量和大小变化[15]。鉴于整合素在调节NK细胞粘附和穿透血管内皮细胞的迁移中的重要调控作用，推测CD49d和CDllb在妊娠早期CD56+CD16-NK细胞由外周血向子宫的募集中扮演者重要的调控角色，同时妊娠子宫局部微环境可能影响了外周血CD56+CD16-NK细胞募集到子宫后的表型变化。所以本研究把两种亚型表面整合素分子CD49d及CD11b作为检测指标。

本研究分析了IVF-ET术后患者妊娠早期合并绒毛膜下血肿与未合并绒毛膜下血肿者外周血中CD56+CD16+NK细胞、CD56+CD16-NK细胞及其细胞表面CD49d和CD11b的表达水平。结果显示两组外周血中CD56+16-NK细胞、CD56+CD16+NK细胞占淋巴细胞百分比无差异，可能原因是妊娠早期合并SCH孕妇子宫蜕膜NK细胞水平与正常妊娠妇女无明显变化，仅仅是由于蜕膜NK细胞的活性或功能受损导致妊娠期并发症的发生。既往文献报道，妊娠期子宫蜕膜局部血管生成因子的升高可能影响母胎界面滋养层细胞的生物学功能，参与妊娠并发症的发生发展[16]。本研究中，CD11b在CD56+CD16+NK细胞和CD56+CD16-NK细胞表面表达观察组均低于对照组，提示CD11b在参与细胞-细胞间的黏附反应，调节pNK细胞到子宫的募集有重要作用。进而推测CD11b在妊娠早期NK细胞缺乏表达，造成滋养层细胞侵袭能力下降，母胎界面血流异常，影响胚胎着床或浅着床，甚至有可能发生免疫排斥，使绒毛膜板与底蜕膜分离出血，血液在绒毛膜与底蜕膜之间不断积聚，形成绒毛膜下血肿。CD49d参与调节NK细胞与血管内皮的黏附，可影响uNK细胞的数量和大小。抑制性受体和活化性受体分布在uNK细胞表面，对母体界面免疫耐受维持起重要作用；参与蜕膜局部血管生成和螺旋动脉重塑的调控，尤其是在早孕胚胎种植期的血管生成和螺旋动脉重塑过程中发挥着重要的调控作用[17]。CD49d表达下降时，NK细胞与血管内皮的黏附能力下降，uNK细胞作用减弱，可能与绒毛膜血肿的发生相关。但本次研究结果提示CD49d在观察组仅略低于对照组，未见到统计学差异，考虑可能原因是入组患者均处于妊娠状态，无法获取蜕膜组织，所采集的外周血标本可能不能完全反映uNK的作用。

综上所述，CD11b的表达可能在外周血中pNK转化为蜕膜化的uNK细胞中发挥了重要作用。当CD11b表达下降时，细胞与细胞间黏附作用下降，uNK的募集减少，进而影响绒毛向子宫壁植入，导致绒毛膜下血肿；绒毛膜下血肿可能打破母胎界面的免疫平衡，损伤绒毛组织，导致不良妊娠发生。本文初步研究发现有一定意义，但对妊娠结局的影响仍需要进一步研究证实。