健康与感染黑胫病烟株根际土壤与茎秆细菌群落结构与多样性

向立刚 ，汪汉成, ，郭华, ， 周浩 ，谢红炼，蔡刘体，丁伟，余知和

1 长江大学生命科学学院 湖北荆州荆秘路88号 434025；2 贵州省烟草科学研究院 贵州贵阳龙滩坝路29号 550081；3 西南大学植物保护学院 重庆天生路2号 400715；4 贵州省疾病预防控制中心 贵州贵阳八鸽岩路101号 550004

烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草变种（Phytophthora parasitica var. nicotianae）[1]引起的一种典型土传病害，其病原菌以菌丝体、卵孢子以及厚垣孢子在土壤、堆肥或残余植物组织上越冬，并能够在附着载体中存活2～3 年。该病可在烟草全生育期发生为害[2]，团棵期和开花现蕾期发病最为严重[3]。自然环境中寄生疫霉烟草变种游动孢子从烟株茎基部侵染，然后扩散至维管束，导致烟株维管束萎蔫、茎基部坏死，最终造成烟株死亡[4-5]。迄今为止全世界已发现的烟草黑胫病菌存在0 号、1 号、2 号和3 号4 个生理小种，其中0 号和1 号生理小种在烟草上最为常见[6]。如今烟草黑胫病已经成为制约我国烟草生产的主要病害之一，在全国各大烟区均有发生，它常与烟草青枯病混合发生[7-8]，增加了烟草土传病害的防治难度。

植物土传病害的发生与根际微生物有着紧密的联系，当土壤环境中有益菌群数量降低，有害菌群数量增加时，病害发生率便显著增加[9-10]。李艳丽等[11]在草莓生长期施用生物有机肥料后，显著提高了有益菌芽孢菌属的相对丰度，草莓根腐病发病率降低了36.3%。刘海洋等[12]研究发现作物轮作、微生物防治、深翻等调控措施能够增加土壤中有益菌群数量，降低棉田土壤中大丽轮枝菌数量，从而减轻棉花黄萎病危害。病原菌侵染也会影响植物微生物群落结构。罗路云等[13]研究发现南瓜白粉病菌的侵染能够改变南瓜叶际细菌群落结构，随着病情等级的提高，叶际细菌α 多样性呈先增后减的趋势。茄科劳尔氏菌侵染番茄可显著增加番茄根际土壤中微生物的总量[14]。施河丽等[15]发现感染青枯病烟株根际土壤中芽孢杆菌等益生菌数量减少，而劳尔氏菌等病原菌含量显著增加。烟草黑胫病作为常见的烟草土传病害，感染烟株后必定会改变烟株各部位细菌群落结构与多样性，而关于烟株感染黑胫病前后细菌群落结构与多样性变化却鲜有报道。Illumina MiSeq 高通量测序技术作为环境微生物多样性研究的新型技术手段，如今已广泛用于土壤[16-17]、水体[18]、肠道[19]等微生态系统的微生物多样性研究。为此，本研究利用Illumina MiSeq 高通量测序技术对感染黑胫病烟株根际土壤、发病茎秆、病健交界茎秆和健康烟株根际土壤、茎秆样品细菌群落结构与多样性进行分析，以期弄清黑胫病的危害对烟株各部位细菌群落结构的影响，揭示细菌群落在黑胫病发生过程中的生态作用机理，为烟草黑胫病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018 年8 月于贵州省福泉市烟草黑胫病爆发严重的烟田（种植易感黑胫病品种‘云烟87’）进行样品采集。随机选取4 株黑胫病发病严重的烟株，除去烟株根围地表土壤，将烟株整株拔起，去除烟株主体土壤，抖落并收集须根2 mm 范围的土壤，此即为感染黑胫病烟株根际土壤组（HJTU），样品编号为AHJT、BHJT、CHJT 和DHJT；用经75%酒精消毒的剪刀分别剪取发病茎秆与病健交界茎秆样品，感染黑胫病烟株发病茎秆组（HJJ），样品编号为AHJJ、BHJJ、CHJJ、DHJJ，感染黑胫病烟株病健交界茎秆组（HJBJ），样品编号为AHJBJ、BHJBJ、CHJBJ和DHJBJ。在发病严重田块周围的未发病烟田中，随机选取4 株健康烟株，采集根际土壤与茎秆样品。健康烟株根际土壤组（ZCTU）样品编号为AT、BT、CT、DT，健康烟株茎秆组（ZCJ）样品编号为AJ、BJ、CJ、DJ。样品采集后放入低温保藏箱，迅速带回实验室，-80℃冰箱保存、备用。

1.2 样品DNA 提取

根际土壤采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit （Omega Bio-tek，D5625-02）提取样品DNA。茎秆组织在进行DNA 提取前先去除茎秆表皮，排除环境微生物对样品的影响，随后剪取1 cm 长的茎段，其中病健交界处的茎秆组织中发病茎与健康茎各占0.5 cm。所有茎秆样品剪碎后放入研钵中加入液氮研磨成粉末状，最后采用DNeasy Plant miniKit （Qiagen，69104）提取DNA，具体操作步骤根据其产品操作说明进行。提取样品DNA 的浓度与纯度采用NanoDrop 2000 检测，A260/A280 值要求在1.8～2.0 之间。

1.3 目的基因扩增及测序

采 用ABI GeneAmp®9700 型PCR 仪 进行PCR 扩增。以提取DNA 为模板，引物338F （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 扩 增16S rRNA 基因的V3-V4 可变区。PCR 扩增体系为20 µL：5×FastPfu 缓 冲 液4 µL，2.5 mmol/L dNTPs 2 µL，5 µmol/L 上、下 游 引 物 各0.8 µL，Fast Pfu 聚合酶0.4 µL，20 ng/µL 模板DNA 1 µL，牛血清蛋白BSA 0.2 µL，最后用灭菌的双蒸水将反应体系补至20 µL。PCR 反应程序参数：95 ℃预变性3 min，27 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Axyprep DNA 凝胶回收试剂盒（AXYGEN）切胶回收PCR 产物，纯化后送上海美吉生物医药科技有限公司，利用Miseq PE300 平台（Illumina）进行高通量测序。

1.4 测序数据管理

原始数据使用Trimmomatic 软件进行质控：过滤reads 尾部质量值低于20 的碱基，然后去除质控后50 bp 以下的reads 以及含N 碱基的reads；根据PE reads之间的overlap 关系，将成对reads 拼接成一条序列，最小overlap 长度为10 bp；拼接序列的overlap 区允许最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；最后根据序列首尾两端的barcode 和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许错配数为0，最大引物错配数为2。使用FLASH 软件进行拼接。根据97%相似度使用UPARSE 软 件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）对序列进行OTU （Operational Taxonomic Units）聚类，并在聚类过程去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier （http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 数据库（SSU123），设置置信度阈值为70%。通过对样品进行Alpha 多样性分析、物种组成及差异分析等，评估黑胫病发生对烟株根际土壤及茎秆细菌群落结构及多样性的影响。以上分析均在上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger 生信云网站平台（http://www.i-sanger.com/project/index.html）完成。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA 基因测序深度分析

稀释曲线（Rarefaction curve）用来检查测序结果是否合理。图1 中5 组共20 个样品在测序深度为20000 时曲线趋于平缓，说明测序深度已经足够，测序结果中包含样品中95%以上的细菌类群，能够满足后续样品间细菌群落结构的比对分析。

2.2 数据质控

图1 稀释曲线 (OTU 水平Sobs 指数)Fig. 1 Rarefaction curve (Sobs index of OTU level)

原始序列经优化处理后，健康烟株根际土壤样品与茎秆样品总序列数和总碱基数均显著高于感染黑胫病烟株样品，序列平均长度均为435 bp（HJBJ 组为441 bp），如表1。

表1 测序样品数据质控Tab. 1 Data quality control of sequencing samples

2.3 OTU 聚类分析

如表2 所示，黑胫病菌侵染烟株后细菌各分类水平种数较健康烟株均有增加。其中烟株根际土壤细菌增加1 个纲、3 个目、7 个科、12 个属、16 个种、8个OTU；茎秆样品细菌增加3 个门、2 个纲、9 个目、14 个科、10 个属、13 个种、15 个OTU；病健交界茎秆相对于健康茎秆增加3 个门、3 个纲、15 个目、30 个科、52 个属、69 个种、85 个OTU。烟株感染黑胫病后各部位细菌群落结构均有改变，病健交界部位变化最显著。

表2 健康与感染黑胫病烟株根际土壤与茎秆组织不同分类水平细菌群落数Tab. 2 Total amount of bacterial communities in rhizosphere soil and stem of healthy and black shank tobacco plants at different taxonomic levels

图2 结果表明，健康烟株与感染黑胫病烟株根际土壤共有的细菌属为384 个，相对丰度大于1% 的属有：鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas） （4.47%）、Candidatus_solibacter（4.22%）、芽单胞 菌 属（Gemmatimonas） （3.81%）、Bryobacter（2.38%）、鞘脂菌属（Sphingobium） （2.34%）、节 杆 菌 属（Arthrobacter） （1.81%）、Granulicella（1.64%）、劳尔氏菌属（Ralstonia） （1.34%）、硝化螺旋菌属（Nitrospira） （1.24%）、Blastocatella （1.16%）、产黄杆菌属（Rhodanobacter） （1.08%）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium） （1.02%）。健康烟株土壤中独有的细菌属为16 个，相对丰度大于1%的属有：Defluviicoccus（13.33%）、拟普雷沃菌 属（Alloprevotella） （11.11%）、Saccharibacillus（4.44%）、Solibacillus（4.44%）、Polycyclovorans （4.44%）、阿克曼菌属（Akkermansia） （4.44%）、Dietzia （2.22%）、帕拉普氏菌属（Paraprevotella） （2.22%）、Solitalea （2.22%）。感染黑胫病烟株土壤中独有的细菌属为28个，相对丰度大于1%的属有：Neochlamydia（26.19%）、磁螺菌属（Magnetospirillum） （17.26%）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium） （5.36%）、萨特菌属（Sutterella） （4.17%）、乳杆菌属（Lactobacillus） （3.57%）、柯林斯氏菌（Collinsella） （3.57%）、游动放线菌属（Actinoplanes） （2.98%）、Adhaeribacter（2.38%）、微枝形杆菌属（Microvirga） （2.38%）、嗜血杆菌属（Haemophilus） （1.79%）、藤黄色杆菌属（Luteibacter） （1.79%）、Paucimonas（1.79%）、产碱杆菌属（Alcaligenes） （1.79%）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_12） （1.79%）、另枝菌属（Alistipes） （1.79%）。

健康烟株茎秆、发病烟株茎秆发病部位和病健交界部位3 组样品中共有的细菌属为41 个，相对丰度大于1% 的属有：蓝细菌（norank_c_Cyanobacteria） （53.49%）、劳尔氏菌属（36.53%）、肠杆菌属（Enterobacter） （1.08%）。发病烟株茎秆发病部位和病健交界部位组织共有的细菌属为16个，相对丰度大于1%的属有：蓝细菌（48.80%）、劳尔氏菌属（37.74%）、泛菌属（Pantoea） （1.21%）。发病烟株茎秆病健交界部位与健康茎秆组织共有的属为18 个，相对丰度大于1%的属有：蓝细菌 （51.10%）、劳尔氏菌属（36.53%）、肠杆菌属（1.54%）、泛菌属（1.15%）。发病烟株茎秆发病部位与健康烟株茎秆组织共有的菌属为5 个，相对丰度大于1%的菌属有蓝细菌 （59.88%）和劳尔氏菌属（34.93%）。发病烟株茎秆病健交界部位中独有的属有51 个，相对丰度大于1%的属有：类芽孢杆菌属（Paenibacillus）（9.56%）、Citricoccus（8.09%）、 假 丁 酸 弧 菌属（Pseudobutyrivibrio） （7.35%）、 黄 杆 菌 属（Flavobacterium） （3.68%）、考拉杆菌属（3.68%）、Cellulomonas（2.94%）、Ruminococcaceae_UCG-014 （2.21%）、阿克曼菌属（2.21%）、乳球菌属（Lactococcus）（1.47%）、双歧杆菌（Bifidobacterium）（1.47%）、产碱杆菌属（Alcaligenes） （1.47%）、Sphingopyxis（1.47%）、Bosea（1.47%）。发病茎秆中独有的属有22 个，相对丰度大于1%的菌属包 括：Coriobacteriaceae_UCG-002 （28.13%）、Nakamurella（3.13%）、 根 杆 菌 属（Rhizobacter） （3.13%）、库兹涅尔氏菌属（Kutzneria） （3.13%）、无色杆菌属（Achromobacter） （3.13%）、微小杆菌属（Exiguobacterium） （3.13%）、Duganella（3.13%）、螺杆菌属（Helicobacter） （3.13%）、Blastocatella（3.13%）、棒杆菌属（Corynebacterium） （3.13%）、芽 生 球 菌 属（Blastococcus）（3.13）%、 亚 硝 化螺 菌 属（Nitrosospira） （3.13%）、Deinococcus（3.13%）、大理石雕菌属（Marmoricola）（3.13%）、Aerococcus（3.13%）。健康茎秆组织中独有的属有10 个，相对丰度大于1%的细菌属包括：瘤胃球菌属（Ruminococcus） （28.57%）、拟杆菌属（Parabacteroides） （14.29%）、黄单胞菌属（Xanthomonas）（7.14%）、丙 酸 杆 菌 属（Propionibacterium）（7.14%）、Chitinophaga（7.14%）、赖氨酸单胞菌（Lysinimonas） （7.14%）、Pseudolabrys（7.14%）、Nannocystis（7.14%）、Taibaiella（7.14%）、Pedobacter（7.14%）。

图2 健康与感染黑胫病烟株根际土壤与茎秆的细菌群落Venn 图(属水平)Fig. 2 Venn map of bacterial communities in rhizosphere soil and stem of healthy and black shank tobacco plants (Genus level)

2.4 细菌多样性指数分析

如表3 所示，土壤样品Sobs、Chao1、Shannon指数值均大于茎秆样品，Simpson 指数小于茎秆样品，表明根际土壤中细菌群落的丰富度与多样性均高于茎秆样品。健康烟株根际土壤中Sobs、Simpson 和Chao1 指数均小于感染黑胫病烟株根际土壤样品，而Shannon 指数大于感染黑胫病烟株根际土壤样品，表明健康烟株根际土壤细菌群落丰富度低于感染黑胫病烟株根际土壤，而群落多样性高于感染黑胫病烟株根际土壤。黑胫病烟株茎秆发病部位与病健交界部位样品较健康烟株茎秆细菌群落丰富度与多样性均增加，病健交界部位茎秆中细菌多样性增加显著。5 组烟株各部位样品覆盖度指数（Coverage index）均到达0.98，表明测序结果合理。

表3 样品细菌群落Alpha 多样性指数(OTU 水平)Tab. 3 Alpha diversity index of sample bacterial community (OTU level)

2.5 细菌群落基本组成和结构分析

图3 门水平样品菌落相对丰度表明，健康烟株根际土壤中主要细菌为变形菌门（Proteobacteria） （33.6 %）、拟杆菌门（Bacteroidetes） （5.99%）、酸杆菌门（Acidobacteria） （19.05%）、放线菌门（Actinobacteria） （12.60%）、绿弯菌门（Chloroflexi） （9.30%）、 芽 单 胞 菌 门（Gemmatimonadetes） （5.19%）、Saccharibacteria （5.58%）、浮霉菌门（Planctomycetes） （1.16%）、Nirospirae （1.17%）、疣微菌门（Verrucomicrobia） （1.60%）；健康烟株茎秆中主要细菌为变形菌门（38.81%）和蓝细菌门（Cyanobacteria） （60.94%）；感染黑胫病烟株根际土壤中主要细菌为变形菌门（37.81%）、酸杆菌门（16.92%）、放线菌门（10.81%）、绿弯菌门（8.54%）、拟杆菌门（5.83%）和芽单胞菌门（5.88%）；感染黑胫病烟株茎秆发病部位中主要细菌为变形菌门（41.24%）和蓝细菌门（58.57%）；感染黑胫病烟株茎秆病健交界部位中主要细菌为变形菌门（59.38%）和蓝细菌门（39.66%）。

图3 各样品中细菌的相对丰度（门水平） Fig. 3 Relative abundance of bacteria in samples (phylum level)

图4 属水平样品菌落相对丰度表明，健康烟株根际土壤中主要细菌为Candidatus_Solibacter（4.27%）、鞘脂单胞菌属（3.65%）、劳尔氏菌属（1.08%）、芽单胞菌属（3.42%）和节杆菌属（2.19%）等；健康烟株茎秆中主要细菌为劳尔氏菌属（33.65%）、肠杆菌属（1.28%）和蓝细菌 （60.94%）；感染黑胫病烟株根际土壤中主要细菌为鞘脂单胞菌属（5.38%）、Candidatus_Solibacter（4.16%）、鞘脂菌属（2.58%）、劳尔氏菌属（1.63%）、芽单胞菌属（4.23%）和Bryobacter（2.77%）。感染黑胫病烟株茎秆发病部位组织中主要细菌为劳尔氏菌属（36.35%）和蓝细菌 （58.57%）；感染黑胫病烟株茎秆病健交界部位组织中主要细菌为泛菌属（2.26%）、肠杆菌属（1.79%）、劳尔氏菌属（38.85%）、Stenotrophomonas（1.81%）和蓝细菌 （39.66%）。

图4 各样品中细菌相对丰度（属水平）Fig. 4 Relative abundance of bacteria in samples at (genus level)

图5 样品属水平相对丰度热图Fig. 5 Heatmap of the relative abundance of genera identified in each sample

样品中细菌群落前30 个属相对丰度热图（图5）结果表明，土壤样品中细菌分布较为均匀，各细菌属相对含量较平均；茎秆样品中蓝细菌、劳尔氏菌属、norank_f_Mitochodria、肠杆菌属、泛菌属和norank_p_Saccharibacteria 相对丰度显著高于其余细菌属。热图左边为各细菌属层级聚类树，表示各物种关系的远近。热图上方为样品层级聚类树，其中土壤样品与茎秆样品明显聚集为两大类，表明两部位细菌群落结构差异明显。土壤样品又聚集为3 小类，AT、BT、BHJT、CHJT 聚集为一类，DHJT、AHJT、CT 聚集为一类，而DT 样品与以上7 个土壤样品细菌群落结构差异较大因而单独聚集为一类。茎秆样品中BJ、AHJBJ、AHJJ 聚集为一类，CJ、CHJJ、DHJBJ 聚集为一类，BHJJ、DJ、DHJJ、AJ、CHJBJ 聚集为一类，BHJBJ 单独聚集为一类。

图6 OTU 水平主成分分析结果表明，导致样品间群落产生差异的主要因素PC1 和PC2 分别占全部影响因素的39.53%、13.24%。感染黑胫病后烟株根际土壤中细菌群落结构产生了明显的差异，在PC2的作用下感染黑胫病烟株根际土壤与健康烟株根际土壤能够明显区分开来，说明PC2 是导致根际土壤产生差异的主要因素。茎秆样品间群落结构差异较小，在PC1、PC2 的作用下均不能将其区分开来，说明黑胫病的发生对于烟株茎秆中细菌群落结构的影响较小。

图6 OTU 水平主成分分析 Fig. 6 Principal component analysis of OTU level

3 讨论

烟株感染黑胫病后能够引起根际土壤及茎秆中细菌群落结构与多样性变化。本研究测序结果中感染黑胫病烟株根际土壤、发病茎秆以及病健交界茎秆样品获得的序列数和碱基数均小于健康烟株样品。而OTU 聚类分析结果表明感染黑胫病烟株根际土壤与茎秆中细菌纲、目、科、属、种以及OTU 的种类数均有不同程度的上升，且感染黑胫病烟株根际土壤和茎秆样品中独有的细菌属高于健康烟株根际土壤和茎秆样品。导致本研究中黑胫病烟株各部位细菌种类增加的原因可能是黑胫病菌侵染使得烟株茎秆枯萎坏死，从而破坏了烟株自身的防御体系，因此外源细菌大量入侵烟株；也可能是黑胫病菌侵染烟株后土壤中的细菌向烟株地上部位迁移的结果，该假设有待在后续研究中加以验证。

一般来讲，生态系统的稳定性与生态系统中微生物的多样性及结构的复杂程度呈正相关，即微生物多样性越高、结构越复杂，系统的稳定性也越高[20-22]。韩腾等[23]研究发现枯草芽孢杆菌处理可以提高样品中细菌多样性及丰富度，从而降低烟草黑胫病病情指数。杨永等[24]通过施用微生物肥料优化哈密瓜根际真菌群落结构，降低了连作积累的病原真菌数量，从而达到了缓解或克服连作障碍。本研究Alpha 多样性分析结果表明，感染黑胫病烟株根际土壤与茎秆中细菌群落丰富度及多样性均高于健康烟株样品（感染黑胫病烟株根际土壤多样性略低于健康烟株根际土壤）。烟草青枯病作为另一种烟草常见病害，发病条件与烟草黑胫病相似，相关研究表明其与烟草黑胫病存在混发的情况，此次研究中在感染黑胫病烟株的根际土壤与茎秆中也发现了茄科劳尔氏菌，再次证实了前人的结论。作者前期研究感染青枯病烟株根际土壤与茎秆细菌群落结构与多样性结果表明，感染青枯病烟株根际土壤与发病茎秆细菌丰富度与多样性较健康烟株样品增加，这与本研究黑胫病侵染烟株后根际土壤与烟株茎秆组织中细菌群落的变化情况基本一致。因此说明烟草黑胫病与青枯病侵染烟株后对烟株根际土壤与茎秆细菌群落的影响作用相似。

健康烟株与感染黑胫病烟株根际土壤中优势菌门为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门以及芽单胞菌门等。这与蒋景龙等[25]对西洋参根腐病发病前后土壤细菌结构以及许艳蕊等[26]对玉米土壤细菌研究的结果一致。感染黑胫病后烟株土壤中变形菌门相对丰度增加4.21%，酸杆菌门降低2.13%，放线菌门降低1.79%，Saccharibacteria、疣微菌门、浮霉菌门和Nirospirae 从相对丰度大于1%降至1%以下。变形菌门是最为普遍的细菌菌门[27]，同时也包含大量动植物病原菌[28]，其相对含量增加可能引起土壤环境抵抗力降低，植株发病率增加。放线菌门中包含许多可产抗生素、酶和有机酸等的细菌，其含量的高低可作为土壤健康状况的评价指标[29]。烟株感染黑胫病后根际土壤中变形菌门相对丰度增加，而放线菌相对丰度降低，表明黑胫病侵染使烟株根际土壤健康状况下降。发病茎秆较健康烟株茎秆中变形菌门增加2.43%，蓝细菌门降低2.37%。病健交界茎秆较健康茎秆中变形菌门增加20.57%，蓝细菌门降低21.28%。相比发病茎秆，病健交界茎秆中变形菌门相对丰度更高，可能是由于病健交界处存在健康植物细胞能够进行正常生理代谢并产生营养物质，趋使变形菌门等异养细菌向此聚集。

在属水平上，茎秆样品中蓝细菌的相对丰度较高在39%～61%之间，蓝细菌作为植物内生菌并不常见，尤其作为烟草内生菌。本次测序在烟草茎秆中发现大量蓝细菌，很可能是植物基因组的污染。所有样品中均有劳尔氏菌属存在，劳尔氏菌为烟草青枯病病原菌，表明本文所采集的烟草黑胫病健康与感病烟株均携带有青枯病菌。除了感染黑胫病烟株，健康烟株中同样存在劳尔氏菌属。健康烟株茎秆中劳尔氏菌属相对丰度高达33.65%，但未表现出典型病症。已有研究表明茄科劳尔氏菌共分为5 个生理小种[30-31]，各生理小种致病力存在一定差异。而本研究中健康烟株上的劳尔氏菌很可能为弱致病力或无致病力菌株，或者烟株携带强制病力菌株但还未表现出青枯病特有的肉眼可识别的病症。除病原菌外，环境因素和烟株自身的性质也可能影响病害的发生。相关推测有待在以后实验中进一步研究。

4 结论

本研究通过Illumina 高通量测序分析明确了黑胫病侵染对烟株根际土壤和茎秆中细菌群落结构及多样性的变化，为烟草黑胫病的生物防治提供了借鉴。同时也发现烟草黑胫病与青枯病通常混合发生。本研究只是对烟株感染黑胫病后一个时期的细菌群落结构及多样性进行了分析，尚缺乏对烟株各个生长阶段和发病阶段细菌多样性研究，以及真菌群落多样性分析，在今后的研究中会加以完善。