云南省烟草正番茄斑萎病毒属病毒的调查和鉴定

高雪，王偲博，李正洋，杨宝菊，飞进强，刘雅婷*

1 云南农业大学，农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2 云南省测绘地理信息局地图院，云南 昆明 650034

烟草，是云南省的一种重要的经济作物，其种植面积和产量位居中国首位[1]。然而，正番茄斑萎病毒属病毒（Orthotospoviruses）是一类重要的植物病原物，严重危害云南烟草产业，属于正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus），番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），布尼亚病毒目（Bunyavirales）[2]。烟草感染正番茄斑萎病毒属病毒后，出现烟叶坏死、畸形、褪绿、顶芽坏死等症状，影响烟草的经济效益[3]。Orthotospovirus属病毒主要通过蓟马以持久增殖型方式传播[4]，在田间可传播该属病毒的蓟马属于缨翅目（Thysanoptera）蓟马科（Thripidae）的花蓟马属（Frankliniella）和蓟马属（Thrips），主要有西花蓟马（Frankliniella occidentalis）、花蓟马（Frankliniellaintonsa）、棕榈蓟马（Thrips palmi）、烟蓟马（Thrips tabaci），细角带蓟马（Taeniothrips eucharii）[5]等，郑雪[6]等人研究发现，云南省烟田中正番茄斑萎病毒属病毒的传毒蓟马主要是烟蓟马和花蓟马等。

1915 年，Brittlebank 在澳大利亚的番茄植株上发现了一种新的病害症状“斑驳、萎蔫”，这是关于番茄斑萎病毒病的最早描述[7]。1930 年，Samuel[8]等人确定了引起这种症状的原因是由于病毒侵染，将该病毒命名为“番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV)”。截止目前，该属有31 种病毒被发现及鉴定，其中18 个确定种和13 个暂定种[9]。Orthotospovirus 属病毒粒子呈球状，直径约为80-120 nm；粒体外层由一层脂质包裹，脂质由两种被称为糖蛋白（Glycoprotein，Gn/Gc）的多糖蛋白组成；脂膜内部为核壳体蛋白（Nucleocapsid protein，N）构成的病毒衣壳[10]。N 蛋白是Orthotospovirus属病毒中最保守的蛋白，N 蛋白序列相似值是用于鉴定种和血清组划分的主要依据[11]。Orthotospovirus属病毒寄主范围广泛，其代表种番茄斑萎病毒（Tomatospotted wilt virus，TSWV) 每年可造成达10 亿美元的巨大经济损失，已被列为世界危害最大的10 种植物病毒之一[12]。近年来，RT-PCR 检测是诊断鉴定Orthotospovirus属病毒的重要方法[13]，同时，可以通过制备高效价的核壳体蛋白抗体进行该属病毒种类的检测[14]。

在烟草上，国内最早是1992 年姚革[15]在四川的晒烟上发现TSWV，2010 年Dong[16]等人报道了TSWV 侵染云南烟草，2011 年蔡健和[17]等人首次报道番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV ）侵染中国广西烟草，同年张仲凯[18]等人报道TZSV 侵染云南烟草，2012 年刘雅婷等[19]发现云南文山和楚雄烟草上感染了马蹄莲褪绿斑病毒（Calla lily chlorotic spot virus，CCSV）。由此可见，烟草上Orthotospovirus属的病毒种类在增加。

本研究自2012 年以来对云南省烟草种植区的病害进行调查，采集疑似感染Orthotospovirus属病毒的烟草样品。采用酶联免疫吸附测定和RT-PCR 方法鉴定，生物信息学分析序列并构建系统发育树，确定侵染烟草的正番茄斑萎病毒属病毒的种类。为云南省正番茄斑萎病毒属病毒的防控提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1 材料

图1 烟草样品采集地点分布图Fig. 1 Distribution of tobacco sample collection sites

2012 以来，从云南省昭通、昆明、曲靖、玉溪、楚雄、红河、临沧、保山、大理和丽江地区共采集38份疑似Orthotospovirus属病毒症状的烟草样品（图1），主要症状有烟叶畸形、褪绿、坏死等。

1.2 血清检测

血清检测所用的抗体：番茄斑萎病毒（TSWV，血清组Ⅰ）、凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus，INSV，血清组Ⅲ）、鸢尾黄斑病毒（Iris yellow spot virus，IYSV），番茄褪绿斑病毒（Tomato chlorotic spot virus，TCSV，血清组Ⅱ）＆花生环斑病毒（Groundnut ring spot virus，GRSV，血清组Ⅱ），西瓜银色斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV，血清组Ⅳ）＆花生芽坏死病毒（Groundnut bud necrosisvirus，GBNV，血清组Ⅳ）5 种病毒酶联检测试剂盒购自美国 Agdia 公司。辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus，CaCV）、番茄环纹斑点病毒（TZSV）、马蹄莲褪绿斑病毒（CCSV）、朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV）这4 种病毒的抗体由课题组委托武汉三鹰生物技术有限公司制备。

采用双抗体夹心酶联免疫吸附和间接酶联免疫吸附法检测TSWV，INSV，IYSV，TCSV＆ GRSV，WSMoV ＆ GBNV，CaCV，TZSV，CCSV，检测步骤参照ELISA 试剂盒说明书。以健康植株为阴性对照，样品OD 值/阴性对照OD 值大于2 为阳性反应，OD 值是利用酶标仪在450 nm 和415 nm 波长下测定。

1.3 RT-PCR 检测及测序

PCR检测引用3对正番茄斑萎病毒属通用引物[20,21]和6对由课题组设计特异性N基因引物[22]，具体见（表1）。采用RNA提取试剂盒（全式金，北京）提取38个烟草样本的总RNA，用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa，大连）合成cDNA。在PCR反应管中配置20 µL反应体系为：cDNA 1 µL，Forward Primer （10 µM）1 µL，Reverse Primer（10 µM）1 µL，Prime STAR Max DNA Polymerase 10 µL，ddH2O补充至20 µL。然后分装到各个PCR反应管中进行目的片段扩增。PCR反应程序为：98℃ 10s；98℃ 20s，50℃ 1-2 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min；4℃ 保存。将获得的PCR产物用1.2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，与DNA Maker条带比较，确定出现目的条带的大小。割胶纯化之后，进行克隆转化，测序，获得病毒的N基因序列。

表1 用于烟草样品中病毒鉴定的RT-PCR 引物Tab. 1 RT-PCR primers used for virus identification in tobacco samples

1.4 构建系统发育树

测序返回的烟草样品的N 基因序列，使用MEGA 7.0 软件打开测序公司测序结果的.ab1 文件；观察文件中信号是否单一，是否出现杂峰，重叠峰等现象。如果出现杂峰和重叠峰，则表明该测序结果不可用，需要重新测序；导出FASTA 格式文件；序列分析，删除载体序列；BLAST 序列结果。将分离的21个N 基因序列和从National Center for Biotechnology Information website （NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/）下载的正番茄斑萎病毒属的31 种病毒的N 基因序列进行分析，31 种病毒N 基因序列分别是TNSV （登录号KM355773.1），TNeV （登录号AY647437.1），PhySMV（ 登 录 号AF067151.1），MSMV （登 录 号EU275149.1），GRSV （登 录 号AF251271.1），ANSV （ 登 录 号GQ478668.1），ZLCV （ 登 录 号NC031759.1），MVBaV （ 登 录号NC026619.1），TNRV（ 登 录 号FJ489600.2），LNRV （ 登 录 号AB852525.1），PCSV （ 登 录 号KF383956.1），WSMoV（ 登 录 号NC003843.1），WBNV （登录号GU584184.1），TSWV（登录号JN664252.1），TZSV （ 登 录 号NC010489.1），TYRV（登录号AY686718.1），BeNMV （登录号NC_018071.1），SVNaV （登录号HQ728387.1），PolRSV（登 录 号KJ541744.1），PYSV （登 录 号AF013994.1），PCFV（ 登 录 号AF080526.1），MYSV（ 登 录 号NC008300.1），IYSV（ 登 录 号AF001387.1），INSV（登录号GU112504.1），PNSV（登录号HE584762.1），GBNV（登录号NC003619.1)，CSNV（ 登 录 号AB600873.1），CCSV（ 登 录 号AY867502.1），CaCV（ 登 录 号NC008301.1），HCRV（ 登 录 号JX833564.1），TCSV（ 登 录 号AF282982.1）。选用MEGA 7.0 中集成的Clustal W进行多序列比对，通过Neighbor-Joining 法进行系统发育分析，Bootstrap 为1,000 次。

2 结果

2.1 血清鉴定结果

血清检测结果显示，38 份烟草样品中有16 份样品检测出Orthotospovirus属病毒，16 份样品检测出17 份Orthotospovirus属病毒的分离物，CaCV 0 份，TZSV 2 份，CCSV 2 份，HCRV 3 份，TSWV 10 份，INSV 0 份，IYSV 0 份，TCSV＆GRSV 0 份，WSMoV＆GBNV 0份，其中NT-16 是TSWV 和HCRV 复合侵染（表2）。

2.2 RT-PCR 鉴定结果

RT-PCR 检测结果显示，38 份烟草样品中有20份样品感染Orthotospovirus 属病毒，其中TSWV 单独侵染的样品11 份，集中在昆明市、玉溪市、曲靖市、昭通市、楚雄州和红河州；HCRV 单独侵染样品4 份，集中在保山市、昭通市；TSWV&HCRV 复合侵染1 份在曲靖市；TZSV 单独侵染2 份在昆明市；CCSV 单独侵染样品2 份在丽江市和昭通市（表2）。

2.3 烟草上正番茄斑萎病毒属病毒N 基因的进化分析

图2 Orthotospovirus 属病毒N 基因序列的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree based on N gene of Orthotospoviruses

表2 烟草样品中Orthotospovirus 属病毒种类鉴定结果Tab. 2 Identification of Orthotospoviruses in tobacco samples

如系统发育树（图2）所示，12 份烟草样品的分离物与TSWV 相似度达到93%，5 份烟草样品的分离物与HCRV 相似度达到98%，2 份烟草样品的分离物与TZSV 相似度达到94%，2 份烟草样品的分离物与CCSV 相似度达到97%。由此可见，系统发育树的分析结果和RT-PCR 的检测结果相一致。

3 讨论

自1989 年在我国广州珠江三角洲的花生上发现TSWV 以来[23]，在四川[15]、云南[24]、北京[25]、贵州[26]、宁夏[27]、天津[28]、山东[29]、重庆[30]、湖北[31]、黑龙江[32]等 14 个地区报道Orthotospovirus属病毒的发生，Orthotospovirus属病毒的自然寄主包括烟草、辣椒、番茄、甜瓜、西瓜、莴苣、蜘蛛兰、鸢尾和蝴蝶兰等经济作物。由于云南省具有生物多样性、以及丰富的气候资源和传播介体种类为正番茄斑萎病毒属病毒的发生、传播提供条件[33]，我国现已报道Orthotospovirus属病毒有12 种，其中云南有8种，包括番茄斑萎病毒（TSWV）[34]、凤仙花坏死斑病毒（INSV）[35]、马蹄莲褪绿斑病毒（CCSV）[19]、番茄环纹斑点病毒（TZSV）[36]、朱顶红褪绿环斑病毒（HCRV）[37]、花生环斑病毒（GRSV）[24]，辣椒褪绿斑病毒（Pepper chlorotic spot virus，PCSV)[38]和西瓜银色斑驳病毒（WSMoV）[39]，其中 TSWV 在云南番茄上发病最为严重，平均检出率为 13.11%[40]。云南省是我国Orthotospovirus属病毒种类最多、发病最严重的区域。

近年来，烟草上由蓟马传播的正番茄斑萎病毒属病毒引起的烟草斑萎病危害日趋严重[6]，造成极大的经济损失。由于云南省气候多样，而且干旱范围增加、程度的加深等问题的出现，加重病虫害的发生，加速以蓟马为传播介体的正番茄斑萎病毒属病毒病的传播。本研究发现云南省烟草上的Orthotospovirus属病毒除了TSWV、TZSV、CCSV，还出现了HCRV，以及HCRV&TSWV 复合侵染。HCRV&TSWV 复合侵染烟草后，出现严重的黄化、沿叶脉坏死的现象。

植物病毒的检测主要采用 ELISA，检测过程操作简便、准确性强、易标准化、规模生产等，可以用于检测田间Orthotospovirus属病毒[21]。本研究对采自云南省10 个地州市烟田的38 个烟草样本采用 ELISA 和 RT-PCR 法检测，两种方法检测结果的符合率85%，采自昭通市 NT-11，红河州 NT-14，保山市 NT-34 和 NT-37 样品RT-PCR 检测出Orthotospovirus属病毒，而ELISA 方法没有检测到Orthotospovirus属病毒，可能由于样品中病毒量较低，导致血清学方法没有检测到Orthotospovirus属病毒。

4 结论

本研究对云南省10 个地州市采集的38 份烟草上Orthotospovirus属病毒进行鉴定。结果表明：（1）38 份疑似Orthotospovirus属病毒的烟草样品有12 份感染了TSWV，占比31.58%，TSWV 是侵染云南烟草的斑萎类病毒优势种，主要集中烟草的主栽区，包括昆明市、玉溪市、曲靖市、昭通市、楚雄州等地区；（2）云南烟草首次报道了HCRV 在烟草上的发生，集中在保山市、昭通市，并发现TSWV&HCRV复合侵染的情况；（3）同一个地区的烟草同时感染2-3 种Orthotospovirus属病毒。本研究报道HCRV、CCSV、TZSV、TSWV、TSWV&HCRV 侵染烟草，Orthotospovirus属病毒侵染烟草的范围不断扩大，病毒种类也不断增多，给病毒的防治带来一定的难度。本研究明确了云南烟草上Orthotospovirus属病毒发生情况，对科学制定烟草正番茄斑萎病毒属病毒的防治措施，保障云南省烟草种植业的持续健康发展提供一定的理论依据。