马钱子碱诱导人脐静脉内皮细胞凋亡过程中血管内皮生长因子和上皮细胞激酶A2的表达变化

徐 萌，李 平

马钱子又称番木鳖、苦实等，入药为干燥成熟的种子。始载于《本草纲目》中，临床上用于跌打损伤、痹症风湿、疮毒痈肿等。马钱子主要活性生物碱单体成分马钱子碱(brucine)，又称番木鳖碱。近年来有文献报道，马钱子碱有一定的抗感染、抗肿瘤功效[1]。在肿瘤发生过程中，血管生成是基础[2]。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)是常用的进行血管内皮细胞功能实验的细胞模型[3]。马钱子碱抗肿瘤作用中有无抑制肿瘤血管生成目前已见文献报道，该实验通过探索马钱子碱诱导HUVECs增殖活性和细胞凋亡的影响，并探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和上皮细胞激酶A2(epithelial cell kinase A2，EphA2)的表达变化，从而为临床使用马钱子碱抗肿瘤作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料马钱子碱(成都普菲德生物技术有限公司)；高糖的DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(美国Gibco公司)；羊抗人VEGF抗体(美国Proteintech公司)；羊抗人EphA2抗体(美国RD Systems公司)；Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶(PI)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)；HUVECs(上海肿瘤细胞研究所)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养实验 HUVECs的培养与传代HUVECs细胞用含有10%胎牛血清高糖的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养，每2 d换液1次，3～5 d传代1次，实验用细胞为3～10代细胞。

1.2.2CCK-8方法检测马钱子碱对HUVECs活性的影响 取对数生长期的HUVECs细胞，按照5×103个/孔细胞将接种在96孔板，设未给药的HUVECs为对照组(仅含培养基)、不同剂量马钱子碱(1、5、10、 20、40、80、160 μmol/L)处理组，每组设6个复孔5% CO2浓度的培养24 h后，加入20 μl CCK-8试剂，培养2 h后，在450 nm处读取吸光度值(A450)，观察细胞增殖抑制情况。细胞活力抑制率(%)=[(A对照组-A试验组)/A对照组]×100%。根据绘制的HUVECs增殖抑制曲线，求得半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值。

1.2.3划痕实验检测马钱子碱对HUVECs迁移的影响 在6孔板背面中线处，先用Marker笔用直尺均匀划线，加入5×105个HUVECs细胞，常规培养48 h后，使用枪头按照划线，垂直划痕，PBS充分洗涤细胞5 min×3次，去除划下细胞，加入含10%胎牛血清的培养基，加入不同浓度马钱子碱(0、10、20、40 μmol/L)，在37 ℃的5% CO2恒温培养箱中培养。按照0 h、24 h取样拍照，计算抑制细胞迁徙率，细胞迁徙抑制率(%)=(初始划痕宽度-24 h划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。

1.2.4Hoechst 33258染色检测马钱子碱对HUVECs凋亡影响 收集不同浓度马钱子碱(0、10、20、40 μmol/L)处理HUVECs 24 h后，PBS漂洗2次后，离心弃去上清液，加入Hoechst 33258染液(终浓度10 mg/L)，避光染色10 min，离心后弃去染液，荧光显微镜下观察照相。

1.2.5Annexin-V/PI双染法检测HUVECS细胞凋亡 实验分组前，在6孔板中接种对数生长期HUVECs的5×105/L细胞悬液，在5% CO2浓度恒温箱中，培养24 h后，加入不同浓度的马钱子碱(终浓度0、10、20、40 μmol/L)处理48 h，弃上清液，4 ℃冷PBS冲洗细胞3 min×2次，试管中加入200 μl结合缓冲液重悬细胞，加入10 μl的Annexin V-FITC，暗室反应15 min；再加入10 μl碘化丙啶(PI)染液，流式细胞仪检测马钱子碱对HUVECs细胞凋亡率。

1.2.6Western blot检测 细胞培养、分组和加药干预同1.2.2项。BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE凝胶电泳以及电转，血清封闭2 h后，加入相应的一抗(羊抗人VEGF抗体1 ∶2 500、羊抗人EphA2抗体1 ∶2 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗涤5 min×3次后，加入二抗，于室温孵育2 h，TBST再次洗涤5 min×3次，显影，扫描条带，以GAPDH作为内参，VEGF、EphA2蛋白表达强度进行灰度比值显示相对表达量。

2 结果

2.1 马钱子碱对HUVECs增殖抑制作用不同浓度的马钱子碱可抑制HUVECs的生长，随着马钱子碱剂量(1、5、10、 20、40、80、160 μmol/L)的升高，对HUVECs的增殖呈明显抑制作用，以对照组抑制率为0计算，随着马钱子碱药物各处理组的浓度增加，增殖抑制作用逐渐增强(P<0.05，P<0.01)，见图1，90%可信区间的IC50为(28.2±2.6)μmol/L。

图1 CCK-8 法检测不同浓度马钱子碱对HUVECs增殖影响与马钱子碱浓度0 μmol/L组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2 划痕实验示马钱子碱对HUVECs迁移抑制作用划痕实验如图2所示，马钱子碱对HUVECs细胞迁移能力的影响，细胞死亡数随着马钱子碱浓度增高而增多，迁移能力越来越低，不同浓度马钱子碱(10、20、40 μmol/L)作用24 h 后，与对照组(0 μmol/L马钱子碱)比较，马钱子碱处理组可抑制HUVECs的迁移，10、20、40 μmol/L浓度组马钱子碱对HUVECs细胞迁移能力下降至(10.7±1.1)%、(21.7±1.9)%、(28.2±2.1)% 。

图2 不同浓度马钱子碱对HUVECs细胞24 h迁移能力的影响

2.3 马钱子碱对HUVECs凋亡的促进作用不同浓度马钱子碱作用24 h后，光学显微镜下观察各组细胞形态的变化。结果发现，与对照组(0μmol/L马钱子碱)比较，随着浓度增加，马钱子碱(10、20、40 μmol/L)对HUVECs的凋亡影响明显，细胞数明显减少，细胞凋亡数明显增加(图3)。

图3 不同浓度马钱子碱对HUVECs细胞凋亡的影响Hoechst33258×200

2.4 流式细胞术检测马钱子碱处理后HUVECS细胞凋亡结果采取流式细胞术，Annexin-V/PI双染实验表明，与对照组(0 μmol/L马钱子碱)(1.76±0.32)%进行比较，不同浓度(10、20、40 μmol/L)马钱子碱处理组作用24 h后，HUVECs早期的细胞凋亡率显著增加(图4)，细胞凋亡率分别为(4.01±0.73)%、(8.56±0.87)%、(10.12±1.07)%，差异有统计学意义(F=7.562、8.129、16.318，P=0.045、0.032、0.003)。

图4 流式细胞术检测不同浓度马钱子碱诱导HUVECs的凋亡

2.5 马钱子碱处理后HUVECS细胞VEGF、EphA2蛋白表达Western blot实验显示，与空白对照相比，随着马钱子碱(10、20、40 μmol/L)处理组内药物浓度的增加，VEGF、EphA2蛋白水平呈下降趋势(图5A)。图像分析显示，与空白对照相比，随着浓度升高，马钱子碱(10、20、40μmol/L)处理组VEGF/GAPDH和EphA2/GAPDH蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图5B。

图5 Western blot法检测马钱子碱对HUVECs细胞VEGF和EphA2的蛋白表达A-D：马钱子碱0、10、20、40μmol/L处理组；与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

血管生成是临床上肿瘤疾病生长、复发和转移的关键环节[1]。抗血管生成是调节肿瘤血管微环境，抑制肿瘤内血管生长，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制增殖。由于多种细胞和信号通路参与肿瘤生长微环境，临床上近年来使用的抗肿瘤血管生成药物疗效有限，且有一定的副作用[4-5]。目前，大量临床研究[6]证实，传统中药由于其低毒、多靶点、多个信号通路作用，抗癌疗效确切，并可诱导肿瘤细胞凋亡，提高机体免疫功能，从而广泛使用。该课题组前期研究[1]证实，马钱子碱具有很好地抗乳腺癌细胞增殖功能。马钱子碱的生物药理作用已成为目前抗肿瘤治疗作用的研究重题。同时，该研究通过划痕实验探讨马钱子碱影响HUVECs的细胞迁移能力，结果表明马钱子碱可以有效抑制HUVECs的迁移。

马钱子碱是提取自传统中药马钱子中的吲哚型生物碱，白色结晶性粉末，剧毒，细胞水平抗肿瘤研究表明，马钱子碱对多种肿瘤具有细胞毒作用，马钱子碱可显著抑制多种肿瘤细胞，如乳腺癌[7]、肝癌[8]等细胞增殖。该研究同样表明，马钱子碱明显抑制HUVECs增殖，且随着马钱子碱处理组的浓度增加，增殖抑制作用增强。在基因严格调控下，细胞可以呈程序性死亡，即细胞凋亡，使得机体细胞增殖生长处于动态平衡；一旦增殖和凋亡失衡，即有可能引起肿瘤。诱导肿瘤细胞凋亡往往是化疗药物抗肿瘤作用的常见机制之一[9]。该研究通过Hoechst 33258检测马钱子碱对HUVECs凋亡影响，结果显示不同浓度马钱子碱作用24 h后，在光学显微镜下，与对照组比较，随着马钱子碱浓度增加，HUVECs细胞数明显减少，核浓缩和碎裂形态的凋亡细胞明显增加，表明马钱子碱浓度依赖性增加细胞凋亡。流式细胞仪定量分析凋亡细胞数表明，马钱子碱处理组明显增加细胞凋亡，且随着马钱子碱浓度的上升，发生细胞凋亡的HUVECs明显增多。故在一定浓度范围内，马钱子碱可能通过诱导HUVECs凋亡，从而抑制HUVECs细胞增殖。但需进一步研究明确马钱子碱诱导细胞凋亡的分子机制，是通过抑制凋亡信号通路关键蛋白Caspase-3，还是升高Bax/Bcl-2蛋白比值，从而更好的为马钱子碱在临床上抗肿瘤血管生成提供依据。

肿瘤发生、生长、侵袭和转移需要新生血管，该过程为一个复杂过程，血管生成是众多促进和抑制血管生成的细胞因子参与过程，需要许多细胞因子参与信号传导途径，VEGF和EphA2是两种重要的血管内皮细胞标志物，新生血管在肿瘤的发生和转移中至关重要，在临床治疗中，如果能阻止肿瘤新生血管，就能阻止肿瘤生成[10]。EphA2具有酪氨酸激酶活性，在细胞生长与分化、血管形成、细胞迁徙与粘附中，均有EphA2 介导的信号参与；而VEGF是最为重要血管生成的促进因子，可特异性的促进细胞激活、增殖，通过控制EphA2与VEGF的表达，有可能调控肿瘤的血管生成，进而调控肿瘤行为[11-12]。该研究表明，马钱子碱可以下调VEGF和EpHA2 的表达，然而是否可以通过激活Caspase-9引起线粒体凋亡途径，导致细胞凋亡尚需进一步研究。

综上，马钱子碱可抑制HUVECs血管生成活性物质VEGF、Eph2的表达，从而抑制HUVECs形成新生血管，有可能成为抗血管生成作用药物。