基于SSR的藕莲新品种（系）指纹图谱构建

孙亚林 朱红莲 刘正位 匡晶 柯卫东

摘要  [目的]利用SSR分子标记构建藕莲品种（系）鉴定的DNA指纹图谱，为藕莲品种鉴定和新品种选育提供技术支持。[方法]利用SSR标记对9个莲藕新品种（系）进行鉴定，统计条带并进行遗传多样性分析，选择核心引物，建立DNA指纹图谱。[结果]从45对引物中筛选到9对多态性引物，对9个品种（系）扩增得到条带，共扩增出52条带，其中差异条带32条，多态性比率为61.54%，扩增片段大小为100～400 bp。选出4对SSR核心引物构建9个藕莲品种（系）的DNA指纹图谱。[结论]藕莲品种遗传多样性水平较低，4对引物组合所构建的DNA指纹图谱可用于藕莲品种鉴定。

关键词  藕莲;遗传多样性;指纹图谱;SSR标记

中图分类号  S  645.1文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2020）04-0096-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.028

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Construction of Fingerprint Map for Root Lotus Varieties（Lines） by SSR

SUN Ya-lin，ZHU Hong-lian，LIU Zheng-wei et al  （Institute of Vegetable，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430207）

Abstract  [Objective]With the aim to identify root lotus varieties，SSR molecular markers were used to get its DNA fingerprint map.[Method] SSR primers were screened out，the PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were carried out for the 9 root lotus varieties，genetic diversity analysis were performed，and the core primers were selected to set up an identified fingerprint system.[Result]9 pairs of primer with clear band and high polymorphism were selected from 45 pairs of primer.A total of 52 bands were amplified from root lotus varieties，32 bands among them were polymorphic，the percentage of polymorphism band（PPB） was 61.54%.Four core primers were selected out to set up fingerprint of 9 root lotus varieties.[Conclusion]The genetic diversity of root lotus varieties was low，DNA fingerprint map constructed by 4 pairs of primer combinations can he used in the identification of  root lotus varieties.

Key words  Root lotus;Genetic diversity;Fingerprint map;SSR markers

蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）为莲科莲属多年生大型水生草本植物，根据莲的用途，可将莲分为3个类型，即藕莲、子莲、花莲，以采收肥大的地下根状茎为目的的称为藕莲，藕莲在我国栽培面积最大，是我国特色的水生经济作物。随着藕莲新品种的日益增多，加强品种识别与鉴定，确保品种的真实性和纯度，优化种植区域品种合理布局，提高生产效率具有重要意义。在生产过程中，品种鉴别主要靠植株高矮、花期、花色、藕的熟性、节间形状等来判断[1]，由于受到不同产区气候、土壤、光照等影响，因此鉴定起来比较困难。品种鉴定不详不利于莲藕新品种的推广，阻碍了莲产业的健康发展。

SSR是一种基于PCR的分子标记，具有操作简单、丰富多态性、重演性高且呈共显性遗传而被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性分析与种质鉴定等方面[2]。该研究拟通过对我国主要推广的藕莲品种（系）进行鉴定，构建藕莲品种（系）的指纹图谱，为藕莲种苗认证和DUS测试过程中近似品种的鉴定提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

试验所有材料为我国主要推广的9个藕莲新品种（系）：鄂莲5号、鄂莲6号、鄂莲7号、鄂莲8号、鄂莲9号、鄂莲10号、新5号、544莲、小白胖，均来自国家种质武汉水生蔬菜资源圃，品种（系）详细信息见表1。

1.2  基因组DNA提取

各材料分别取幼叶1 g，采用CTAB法提取各材料的DNA，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA质量，并用分光光度计检测DNA的浓度和纯度，-20  ℃低温下保存待用。

1.3  PCR扩增与电泳检测

采用公开发表的45对SSR引物 [3-6]，引物由上海生工合成（表2），PCR反应体系：2×Taq mixture 5 μL，DNA模板1 μL，引物（上下游）1 μL，ddH2O 3 μL，共10 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环;72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。PCR产物用6%变性PAGE检测，0.5×TBE电泳缓冲液，恒功率60 W，电泳1.5 h，电泳完毕采用银染显色，观察并照相记录。

1.4  数据分析

只统计清晰、再现性强的条带。扩增产物按同一位点条带有或无分别赋值，有带记为1，无带记为0;统计扩增产物的总条带数和多态性条带数，计算多态性条带比率（PPB）和多态性信息量（PIC），PIC=l-fi2，其中fi为i位点的等位基因频率[7] ，采用NTSYS-pc version 2.10软件计算Jaccard相似指数，按照UPGMA法进行聚类。 统计各引物的多态性位点比例;选择多态性最高的引物组合构建藕莲品种的DNA指纹图谱。

2  结果与分析

2.1  品种遗传多样性分析

从45对SSR引物中，筛选到9对多态性好、带型清晰的引物用于藕莲品种鉴定。9对引物共扩增出52条带，其中差异条带32条，多态性比率为61.54%，扩增片段大小为100～400 bp。平均每个引物组合扩增的多态形条带3.56条，最多的为10条。多态性信息量（PIC）变化幅度较大，最低0.198，NnSSR07引物的PIC最高，为0.642（表3）。部分引物在9个藕莲品种（系）中的扩增结果见图1。

2.2  品种聚类分析

根据9对引物组合的扩增结果对9个藕莲品种（系）进行聚类分析（图2），Jaccard相似系数为0.573～0.972，平均相似系数为0.768。利用非加权组平均法（UPGMA）对供试材料进行聚类分析，在相似系数0.580处可以将藕莲品种（系）分为2个类群，第一类群为544莲和小白胖莲。第二类群为鄂莲5号、6号、7号、8号、9号、10号和新5号，在相似系数为0.620处可以将其分为2个亚组，第一亚组为鄂莲5号、6号、8号;第二亚组为鄂莲7号、9号、10号和新5号。

聚类分析结果表明选用的9对引物能较好地反映9份藕莲品种（系）的亲缘关系，在相似系数0.580附近将9份藕莲品种（系）分成2个类群，遗传多样性相对较低，品种之间的亲缘关系与亲本来源有关，部分品种亲缘关系较为接近，说明部分品种的亲本来源较为狭窄。

2.3  指纹图谱构建

根据每个品种（系）DNA扩增图谱中SSR标记的特异性条带的有无，由l和0形成的有序数字串构成某个品种（系）的特征指纹图谱。表4列出了9份藕莲品种（系）的指纹图谱。从扩增出的32条特征条带中选择了25条谱带将供试9份藕莲品种（系）完全区分开，这25条带是NnSSR07、NS050、NS012、Nelumbo-13这4对引物扩增得到的。

3  小結与讨论

3.1  主要莲藕品种的代表性  藕莲在我国栽培历史悠久，我国是藕莲的主要生产国和消费国。截至2016年，我国莲栽培面积为40万hm2，产量为1 210.4万t[8]，藕莲是我国特色水生蔬菜，在蔬菜周年供应中占据重要地位。我国藕莲品种选育开始于20世纪80年代，经过30多年的发展，新品种选育取得显著成绩，截至2018年，我国选育藕莲新品种达14个，目前市场上推广的藕莲品种绝大部分为鄂莲系列，与传统品种相比，新品种产量提高了30%～50%，极大地促进了我国莲产业的发展[9]。

该试验中所选用的9个藕莲品种（系）均为武汉市农业科学院蔬菜研究所选育，这些品种中栽培面积最大的是鄂莲5号，产量最高的品种是鄂莲9号，熟性最早的是鄂莲10号，该试验所选的9个品种（系）涵盖了不同节型（长节、中节、短节）、不同熟性（早、中、晚熟）及不同熟食口感（脆、中、粉），这些品种在我国不同产区均有种植，具有广泛的代表性。

3.2  SSR标记在品种鉴定中的应用

SSR也称微卫星序列，因其具有等位变异高、共显性遗传、稳定性好、操作简便快速等优点，成为目前植物分子指纹图谱研究中应用最多的遗传标记，已经成功运用于棉花[10]、玉米[11]、烟草[12]、梨[13]、甘薯[14]等植物的指纹图谱构建。在莲研究领域，SSR技术已运用于遗传多样性分析和指纹图谱构建，薛建华等[15]利用17对SSR引物作为72个花莲品种的DNA指纹鉴定条码，结果表明最少8对引物组合可完全区分开68个品种，有4个品种组内全部17对引物均不能区分。2008年，全志武等[16]利用SSR引物对10个藕莲品种进行了图谱构建，用4对SSR引物可以区分10个藕莲品种。为满足生产与社会多元化的需求，一批优质高产的藕莲新品种被选育并推广，也有一批老品种被淘汰，原有SSR指纹图谱已无法对现有品种进行有效鉴定。不同引物的有限组合可以大大提高引物的鉴别能力，该研究利用筛选出9对SSR引物组合对9个藕莲品种（系）进行了遗传多样性分析，并构建了品种的指纹图谱。随着品种数量的进一步增加，这些引物组合的鉴别能力可能会逐渐降低，因此需要筛选更多的多态性好的引物对，用于不断选育出的藕莲新品种的SSR指纹库的构建。

参考文献

[1]

王其超，张行言.中国荷花品种图志[M].北京：中国林业出版社，2005.

[2] 郭瑞星，刘小红，荣廷昭，等.植物SSR标记的发展及其在遗传育种中的应用[J].玉米科学，2005，13（2）：8-11.

[3] HU J H，PAN L，LIU H G，et al.Comparative analysis of genetic diversity in sacred lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.） using AFLP and SSR markers[J].Molecular biology reports，2012，39（4）：3637-3647.

[4] TIAN H L，CHEN X Q，WANG J X，et al.Development and characterization of microsatellite loci for lotus （Nelumbo nucifera）[J].Conservation genetics，2008，9（5）：1385-1388.

[5] KUBO N，HIRAI M，KANEKO A，et al.Development and characterization of simple sequence repeat （SSR） markers in the water lotus （Nelumbo nucifera）[J].Aquatic botany，2009，90（2）：191-194.

[6] PAN L，QUAN Z W，LI S M，et al.Isolation and characterization of microsatellite markers in the sacred lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.）[J].Molecular ecology notes，2007，7（6）：1054-1056.

[7] NEI M.Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Proceedings of the national academy of sciences，1973，70（12）：3321-3323.

[8] 吳曼，宗义湘，赵帮宏，等.中国水生蔬菜产业发展现状、存在问题及发展思路[J].长江蔬菜，2019（2）：35-41.

[9]  柯卫东，黄新芳，李建洪，等.我国水生蔬菜科研与生产发展概况[J].长江蔬菜，2015（14）：33-37.

[10] 匡猛，杨伟华，许红霞，等.中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J].中国农业科学，2011，44（1）：20-27.

[11] 张瑞平，周联东，王文洁，等.玉米杂交种新科891及其亲本SSR指纹图谱的构建[J].中国种业，2019（5）：74-76.

[12] 张铭真，邢雪霞，李晓辉，等.烟草种质资源遗传多样性与群体结构分析[J].中国烟草科学，2016，37（4）：42-47.

[13] 薛华柏，赵瑞娟，王磊，等.梨品种SSR特征指纹图谱与分子身份证构建[J].中国南方果树，2018，47（S1）：42-49，97.

[14] 高闰飞，苏在兴，后猛，等.73 份紫心甘薯品种SSR 标记指纹图谱构建[J].江苏师范大学学报（自然科学版），2019，37（1）：15-19.

[15] 薛建华，姜莉，马晓林，等.莲品种 DNA 指纹图谱的构建[J].生物多样性，2016，24（1）：3-11.

[16] 全志武，汪静，潘磊，等.10个藕莲品种SSR 指纹图谱的构建与品种鉴别[J].中国蔬菜，2008（3）：15-17.