固相萃取-超高效液相色谱法测定人参中5种原人参二醇型人参皂苷的含量

宋春颖, 张华蓉, 郭志谋1,, 闫竞宇1,, 金高娃1,*, 梁鑫淼1,

(1. 中国科学院大连化学物理研究所, 中国科学院分离分析化学重点实验室, 辽宁 大连 166023; 2. 中国科学院大学, 北京 100049; 3. 中科院大化所中国医药城生物医药创新研究院, 江苏 泰州 225300)

人参为五加科人参属(Panax ginseng C. A. Mey)的多年生宿根草本植物[1],历来被中医称为百草之王,不但是滋阴补生、扶正固本的极品,还有利于调节血压、恢复心脏机能、改善神经衰弱以及身体虚弱等病症,甚至有抗肿瘤的作用[2-6]。人参主要活性成分为人参皂苷[7],由皂苷元和糖链组成。其中皂苷元是疏水性基团,一般分为螺甾烷的衍生物(甾族皂苷)、四环三萜和五环三萜(三萜皂苷)3类[8]。糖链是亲水性基团,一般由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸中的一种或几种组成。皂苷的皂苷元可以在不同的位置上连接不同的糖,糖链也可以由一种糖或者多种糖组成,因此皂苷化合物结构多样,也带来不同的药用效果。人参中的皂苷大多数为三萜皂苷,根据母环结构主要分为原人参二醇、原人参三醇及其类似物[9]。不同类型的人参皂苷药理活性亦不相同甚至相反,其中原人参二醇型皂苷具有良好的抗癌活性[10]。

目前人参的分离分析主要存在两方面的问题。一是药典中人参相关药材的前处理过程较繁琐,包括加热回流、过夜提取等[11],或者采用大孔树脂富集皂苷类化合物,整个过程耗时较长,重复性较差,溶剂的消耗量也较大。二是色谱分析时采用高效液相色谱所用的分析时间较长,如中国药典2015版中人参的液相色谱分析时间为100 min[11]。目前已有超高效液相色谱(UPLC)分析人参皂苷的报道,如姜涛等[12]测定了西洋参中西洋参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1,所建立方法的分析时间为30 min。沈小梅等[13]测定了人参酒中6种人参皂苷的含量,建立的方法分析时间为20 min。此外,在前处理方面,也有大孔树脂及C18萃取小柱的应用报道,如郭建博等[14]利用皂苷专用的反相模式固相萃取(SPE)小柱,测定了保健食品中人参皂苷类成分。张培旭等[15]利用超声喷泉替代气溶胶进行传质,改进了超声雾化提取-固相萃取法,并用于西洋参叶中的8种常见人参皂苷的提取。

将固相萃取方法引入中药的前处理可提高分析效率,同时改善样品前处理的重复性,并提高通量[16-18]。反相模式SPE的上样溶液一般为水[19],若采用有机溶剂提取的样品,需挥干有机溶剂并用水复溶后再进行固相萃取柱的上样及富集,而亲水色谱模式的SPE上样溶液一般为有机溶剂[20]。皂苷类化合物既具有亲水性又具有疏水性的结构特点,使其在亲水、反相模式下均有较好的保留[21]。皂苷化合物多采用水饱和正丁醇等有机溶剂提取,提取剂与亲水色谱模式SPE的上样溶液兼容。因此本文发展了用亲水色谱模式的固相萃取材料进行人参皂苷富集与净化的方法,结合超高效液相色谱,实现目标物的快速分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Acquity超高效液相色谱仪配2996型光电二极管阵列检测器(美国Waters); KQ5200DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司); Milli-Q超纯水制备器(美国密理博有限公司);固相萃取装置(VISIPREP 24TMDL);真空离心浓缩仪(美国LABCONCO);离心机(Thermo Sorvall Biofugo)。乙腈(色谱纯,上海迈瑞尔化学技术有限公司),正丁醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂),乙醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂); Click TE Cys亲水色谱模式固相萃取柱(1 g/6 mL,自主研发)。

5种原人参二醇型人参皂苷(Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd,纯度均≥98%)购自四川省维克奇生物科技有限公司,结构如图1所示。

图1 5种原人参二醇型人参皂苷的化学结构Fig. 1 Chemical structures of the five protopanaxadiol ginsenosides

产自吉林省靖宇县的4批、吉林省集安的1批和黑龙江省的2批人参药材,均经中国科学院大连化学物理研究所执业药师杨小平鉴定为人参(Panax ginseng C. A. Mey)的干燥根茎,药材分别经粉碎后过4号筛备用。

1.2 对照品溶液的配制

分别精密称取5种原人参二醇型人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd对照品10 mg,用20%(v/v,下同)乙腈/水溶解,得到质量浓度为5 mg/mL的各人参对照品储备液。上述各对照品溶液用20%乙腈/水制备成混合对照品溶液,质量浓度分别为500、100、50、25、10、5 μg/mL。

1.3 样品前处理

准确称取人参药材粉末100 mg,加入1 mL水饱和正丁醇,将混合之后的溶液超声提取40 min,然后离心(5 000 r/min, 5 min),取上清液,残渣中再加入1 mL水饱和正丁醇,超声40 min,离心(5 000 r/min, 5 min)后取上清液,将两次的上清液合并。合并后的上清液直接上样至活化后的亲水SPE柱(Click TE-Cys),用2 mL正丁醇淋洗后,用3 mL 70%的乙醇/水进行洗脱,收集洗脱液。洗脱液离心浓缩后用1 mL 20%的乙腈/水复溶,备用。

1.4 液相色谱方法

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流动相A为乙腈,流动相B为水。梯度洗脱条件:0～5 min, 29%A～29%A; 5～20 min, 29%A～36%A; 20～21 min, 36%A～95%A; 21～25 min,保持95%A不变。流速为0.3 mL/min;检测波长为203 nm;进样体积为3 μL;柱温为30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1SPE条件的优化

前处理过程中最重要的步骤是人参皂苷的富集与净化,采用固相萃取方法不仅方便快速,而且操作简单,重复性较好。人参皂苷由于结构的特殊性,既有亲水性的基团,又存在疏水性的基团,在反相和亲水色谱模式下都有较好的保留[21],因此除反相色谱材料外,可以选择亲水色谱模式的固相萃取材料,这样经过有机溶剂提取之后可以直接上样至固相萃取柱,不需要再经过浓缩复溶的步骤,简化了前处理过程。

图2 不同SPE洗脱液条件下的人参提取物的色谱图Fig. 2 Chromatograms of ginseng extract with different SPE eluents SPE eluent: 2 mL ethanol/water; ethanol volume percentage: (a) 80%, (b) 70%, (c) 60%, (d) 50%. HPLC mobile phase A: ACN; B: H2O; gradient elution time: 0-10 min, 19%A-19%A; 10-16 min, 19%A-29%A; 16-20 min, 29%A-29%A; 20-28 min, 29%A-40%A; 28-34 min, 40%A-90%A; 34-40 min, 90%A-100%A; flow rate: 0.3 mL/min; detection wavelength: 203 nm; column temperature: 30 ℃. Peak identifications: 1. Rb1; 2. Rc; 3. Rb2; 4. Rb3; 5. Rd.

根据课题组前期研究,选择了亲水性能极好的分离材料Click TE Cys[22]进行人参皂苷的富集和净化,并进行了洗脱液和洗脱体积的优化。优化洗脱液时,配制体积分数为80%、70%、60%、50%的乙醇/水溶液,采用各2 mL进行SPE洗脱。结果如图2所示,体积分数为70%的乙醇/水溶液(见图2b)可将大部分目标皂苷化合物洗脱下来。进一步优化洗脱液体积,结果如图3所示。第2个1 mL体积分数为70%的乙醇/水溶液(见图3b)可洗脱下较多的目标化合物,第3个1 mL体积分数为70%的乙醇/水洗脱液中还有少量的目标化合物。为洗脱完全,最终确定洗脱液为3 mL体积分数为70%的乙醇/水溶液。

图3 不同SPE洗脱体积条件下的人参提取物的色谱图Fig. 3 Chromatograms of ginseng extract with different SPE eluent volumes SPE eluent: 70% (v/v) ethanol/water; volume: (a) 1st 1 mL, (b) 2nd 1 mL, (c) 3rd 1 mL, (d) 4th 1 mL. The chromatographic separation conditions and the peak identifications were the same as those in Fig. 2.

确定固相萃取方法后,对前处理效果进行了对比。称量两份人参样品,其中一份参照药典方法[11]经水饱和正丁醇提取定容后直接进行UPLC的分析。另外一份样品在水饱和正丁醇提取后,进行亲水模式的SPE提取,并接取上样溢出液、淋洗液以及洗脱液进行UPLC分析。结果如图4所示,超声提取液直接色谱分析时,因弱极性物质干扰较大,20～30 min流出的目标物响应不明显且干扰较多(见图4a); SPE过程中的上样溢出液(见图4b)以及淋洗液(见图4c)中没有目标化合物的损失,而SPE洗脱液中(见图4d),目标化合物得到富集及净化,30 min之后的弱极性杂质被去除。液相色谱分析时,若不及时冲柱,这些弱极性物质会积累在色谱柱中,影响色谱柱的重复性和使用寿命。由此可见,所建立的亲水模式的SPE前处理方法具有较好的效果。与中国药典2015版中人参两次回流提取方法[11]相比,SPE方法具有操作简单、通量高、重复性好的优点。

图4 人参提取物经SPE处理的效果Fig. 4 Effect of the SPE processes on the ginseng extract a. without SPE; b. loading effluent of SPE; c. cleaning effluent of SPE; d. eluent of SPE. The chromatographic separation conditions and the peak identifications were the same as those in Fig. 2.

2.1.2UPLC条件的优化

图2～4中UPLC的分析条件是在2015版《中国药典》人参含量测定的液相色谱条件[11]基础上,根据色谱填料粒径的改变,改变流速、进样量和洗脱梯度而得到的[23]。由图2～4可以看出,目标化合物主要集中在中间区域,为进一步缩短分析时间并改善人参皂苷Rd峰的分离度,优化了梯度条件。图5是优化流动相比例后混合对照品和实际样品的色谱图。可以看出,目标物保留适中,分离度良好。

图5 (a)人参皂苷对照品与(b)人参样品提取物的色谱图Fig. 5 Chromatograms of (a) reference standards of ginsenosides and (b) ginseng extract Peak identifications: 1. Rb1; 2. Rc; 3. Rb2; 4. Rb3; 5. Rd.

表 1 5种对照品的线性方程、线性范围、r2、检出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration of the target compound (μg/mL).

2.2 方法学验证

2.2.1线性关系、检出限和定量限

在优化后的色谱分析条件下,利用UPLC分析对照品溶液,以人参皂苷的质量浓度(x, μg/mL)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标建立标准曲线。结果如表1所示,5种人参皂苷在5～500 μg/mL范围内线性关系良好,相关系数(r2)大于0.999。以信噪比(S/N)为3确定5种目标物的检出限(LOD)在1.37～2.56 μg/g之间,以S/N为10确定5种化合物的定量限(LOQ)在4.57～8.54 μg/g之间。

2.2.2精密度试验

按1.3节制备人参供试品溶液,按1.4节色谱条件连续进样、测定6次,记录峰面积。结果见表2。可以看出,5种人参皂苷峰面积的RSD值在0.95%～2.62%之间,说明方法精密度良好。

2.2.3稳定性试验

取1.3节供试品溶液适量,分别于室温下放置0、2、4、8、12、16、20、22 h,按1.4节色谱条件进样、测定。结果表明见表2, 5种原人参二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面积的RSD分别为0.96%、0.92%、1.32%、0.90%、2.15%(n=8),表明供试品溶液室温放置22 h稳定性良好。

2.2.4重复性试验

称取6份人参药材,按1.3节方法平行制备供试样品溶液,按1.4节色谱条件测定,记录峰面积。结果见表2, 5种原人参二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面积的RSD分别为5.35%、6.23%、5.69%、6.47%、5.97%(n=6)。第2天和第3天各称取1份人参药材,按1.3节方法制备供试样品溶液,按1.4节色谱条件测定,记录峰面积。结果见表2, Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面积的RSD分别为5.56%、6.34%、5.59%、6.34%、6.06%(n=8)。结果说明方法的日内、日间重复性良好。

表 2 方法的精密度、稳定性和重复性、

2.2.5回收率试验

在提取前,对人参样品进行加标,加标量为Rb1: 5 mg/mL,加入38 μL; Rc: 5 mg/mL,加入24 μL; Rb2: 5 mg/mL,加入22 μL; Rb3: 1 mg/mL,加入15 μL; Rd: 2 mg/mL,加入36 μL。按1.3节平行处理6份加标样品,按1.4节色谱条件测定,记录峰面积,结果见表3。可以看出,平均加标回收率在87.16%～101.92%范围内,Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面积的RSD分别为3.19%、3.76%、4.02%、1.65%、1.54%(n=6),表明该方法适用于人参中5种原人参二醇型人参皂苷的分析。

表 3 5种化合物在实际样品中的加标回收率(n=6)

2.3 实际样品的分析

环境不同,会导致不同产地人参的皂苷含量有些许差异。应用本方法对7个不同产地、批号的人参样品(编号记为A～G)进行分析。每个批号的样品按1.3节方法平行处理3份,按1.4节方法进行测定,结果见表4。可以看出,黑龙江省样品(E、F)的Rb1、Rb2、Rb3、Rc含量较高;而吉林集安人参样品(G)的Rd含量较高。

表 4 不同人参样品中5种化合物的含量

3 结论

本文采用亲水色谱模式的固相萃取结合超高效液相色谱对人参中5种原人参二醇型人参皂苷的含量进行了测定。该方法选择水饱和正丁醇超声提取人参药材,提取液直接上样至亲水色谱模式的固相萃取小柱进行人参皂苷成分的富集和净化,去除了弱极性化合物的干扰,有利于色谱柱的重复性和使用寿命。此外,该方法快速简单、重现性好,适用于人参中原人参二醇型人参皂苷的定量检测。