固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定蜂蜜中16种黄酮类化合物和阿魏酸

侯建波, 谢 文, 钱 艳, 史颖珠, 陆 顺, 盛 涛, 陈文彬

(1. 杭州海关技术中心, 浙江 杭州 310016; 2. 浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江 杭州 310016; 3. 浙江立德产品技术有限公司, 浙江 杭州 310016; 4. 福建农林大学蜂学学院, 福建 福州 350002)

蜂蜜是营养价值较高的天然物质,富含多种维生素、微量元素、氨基酸及人体可直接吸收的单糖、黄酮类、有机酸类和酶类等营养物质[1]。随着人们生活水平的提高,对蜂蜜的消费需求和质量要求也在不断提升,然而蜂蜜中药物残留量超标、蜂蜜掺假等事件的发生,严重影响了蜂蜜的产业发展和消费者信心。研究人员通过感官评定、色谱法、质谱法、气体稳定同位素比质谱法、核磁共振波谱法等多种方式对蜂蜜中药物残留指标、理化指标和掺假信号开展了系列研究[2-5],以保证蜂蜜的品质和质量。

黄酮类化合物和有机酸是蜂蜜自身含有的有效成分,其化合物的种类和含量高低对评价蜂蜜的质量特别是蜂蜜种类具有重要的辅助作用。快速、准确地检测蜂蜜中黄酮类化合物的成分和含量,对提升蜂蜜质量、确定蜂蜜品种和产地具有积极的意义。

近些年黄酮类化合物的研究主要集中在总黄酮测定[6-8]、活性研究[9,10]、黄酮类化合物成分含量分析等方面[11-16]。其中化合物含量的测定以吸附树脂净化-液相色谱法检测为主，然而液相色谱法测定存在定量限高和多组分分离难度大等不足,检测主要集中在含量较高的常见化合物(如:槲皮素、柚皮素、橙皮素,山柰酚、木犀草素、白杨素和高良姜素等),吸附树脂净化前处理存在蜂蜜取样量大、树脂净化材料和所用试剂多及实验时间长等情况[17,18]。因此,陆续有研究人员通过固相萃取净化-液相色谱-串联质谱法开展黄酮类化合物的检测分析[19,20]。

本文通过C18固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱法测定,建立了同时定量测定蜂蜜中阿魏酸、芦丁、杨梅素、桑黄素、槲皮素、柚皮素、橙皮素、木犀草素、染料木素、山柰酚、异鼠李素、芹菜素、松属素、汉黄芩素、白杨素、高良姜素和芫花素17种化合物(结构式见图1)含量的方法,并进行了系统的方法学考察研究和实际样品分析。该方法具有样品用量少、所需试剂少、检测时间短等特点,可实现蜂蜜中黄酮类化合物的批量、低能耗、快速和高效准确测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

API 4000型三重四极杆串联质谱仪(配电喷雾离子源,AB公司,美国), 1100型液相色谱仪(Agilent公司,美国), Milli-Q Synergy 185型超纯水器(Millipore公司,美国), IKA MS3 Basic型涡旋器(IKA公司,德国), 24孔固相萃取装置(Supelco公司,美国), Heraeus Multifuge X1R型台式离心机(Thermo公司,美国), G&G JJ500型电子天平(双杰公司), Mettler AE260(Mettler Toledo公司,瑞士)。

图1 目标化合物的结构式Fig. 1 Chemical structures of the target compounds

甲醇(色谱纯,美国Tedia公司),甲酸(质谱级,Scharlau公司), C18固相萃取柱(6 mL, 500 mg, Waters公司)。

标准物质:阿魏酸(纯度98.0%)、芦丁(纯度95.0%)、松属素(纯度98.0%)、白杨素(纯度98.0%)、芫花素(纯度97.0%)购自TRC公司;杨梅素(纯度94.0%)、桑黄素(纯度90.9%)、槲皮素(纯度96.4%)、柚皮素(纯度94.9%)、橙皮素(纯度99.0%)、木犀草素(纯度96.9%)、异鼠李素(纯度92.2%)、汉黄芩素(纯度92.9%)、高良姜素(纯度99.6%), ChromaDex公司;染料木素(纯度99.1%)、山柰酚(纯度95.5%)购自中国药品生物制品检定所;芹菜素(纯度98.5%)购自Bepure公司。用甲醇将各化合物标准品溶解,稀释并定容获得10 mg/L标准储备液,根据需要用甲醇将其储备液稀释至所需浓度。

1.2 实验部分

1.2.1样品前处理

称取5 g试样(精确到0.01 g)置于50 mL具塞离心管中,加入20 mL pH 2盐酸溶液, 2 000 r/min涡旋混合5 min,以8 500 r/min离心5 min,取上清液转移至C18固相萃取柱中(依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL pH 2盐酸溶液活化),提取离心管分别用5 mL pH 2盐酸溶液和5 mL水洗涤并转移至固相萃取柱,抽干,加入5 mL甲醇进行洗脱,控制流速1～2 mL/min,收集全部洗脱液于15 mL离心管中,加入水定容至10 mL,摇匀,过0.22 μm有机滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.2色谱参数

色谱柱:Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm, 3 μm)。流动相: A. 甲醇;B. 0.15%(v/v)甲酸溶液。流动相线性梯度洗脱程序:0～10.0 min,40%A～75%A; 10.0～15.0 min,75%A～90%A; 15.0～22.0 min, 90%A;22.0～23.0 min,90%A～40%A; 23.0～30.0 min, 40%A。流速0.4 mL/min,进样量20 μL,柱温25 ℃。

1.2.3质谱参数

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:负离子扫描;监测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS): -4 500 V;雾化气压力(GS1): 289 kPa(42 psi);气帘气压力(GS2): 310 kPa(45 psi);辅助气流速(CUR): 172 kPa(25 psi);离子源温度(TEM): 540 ℃;其他质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

蜂蜜样品中药物残留检测通常采用水溶液将蜂蜜进行稀释,通过有机溶剂提取目标化合物的同时去除蜂蜜中糖分的影响。根据文献[14,15]的研究及黄酮类化合物和阿魏酸偏酸性的性质,实验对比了pH 2盐酸溶液、水、pH 8磷酸盐溶液(13.8 g磷酸二氢钠溶解于950 mL水中,用0.1 mol/L的氢氧化钠调pH=8,定容至1 000 mL)3种环境下的提取效果,结果如图2所示,芦丁、柚皮素、橙皮素、染料木素、松属素、白杨素、芫花素在3种不同pH值环境下提取回收率均大于70%;杨梅素、桑黄素、槲皮素、木犀草素、山柰酚、异鼠李素和高良姜素在pH 2时回收率大于65%,在水和pH 8磷酸盐溶液时回收率小于60%;阿魏酸在pH 2和水中的提取效率大于85%, pH 8磷酸盐溶液的提取效果仅22%。因此,实验最终采用pH 2盐酸溶液对蜂蜜样品进行稀释,净化过程中采用水淋洗来去除蜂蜜中的糖分。

表 1 目标化合物的质谱测定条件

* Quantitative ion.

2.2 净化条件的选择

图2 不同pH条件下各化合物的提取结果Fig. 2 Extraction results for each compound at different pH levels

图3 采用不同固相萃取柱的净化结果Fig. 3 Purification results with different solid phase extraction columns

采用液相色谱-串联质谱法进行定量测定时,通常采用液-液萃取净化、固相萃取净化、QuEChERS等净化方式来降低脂类、蛋白质和糖分等物质带来的背景干扰,减少基质效应的影响,提高检测结果的准确性。本试验考察了C18(3 mL, 500 mg, Anpel公司;6 mL, 500 mg, Waters公司;6 mL, 500 mg, Agilent公司)、HLB(6 mL, 500 mg, Waters公司)和Strata-X 33u(6 mL, 500 mg, Phenomenex公司)3种类型固相萃取柱的净化情况。实验在pH 2盐酸溶液中加入混合标准溶液并转移至活化好的固相萃取柱中,通过5 mL pH 2盐酸溶液和5 mL水依次淋洗,5 mL甲醇洗脱的方式进行净化。结果如图3所示,阿魏酸、芦丁、柚皮素、橙皮素、染料木素、芹菜素、汉黄芩素在不同固相萃取柱的净化回收率均大于70%,其他化合物在采用HLB固相萃取柱时杨梅素、白杨素和芫花素净化回收率小于65%, Strata-X 33u固相萃取柱时杨梅素、桑黄素、槲皮素、山柰酚、白杨素、高良姜素和芫花素的净化回收率小于68%, 3种C18固相萃取柱净化的回收率均大于80%,最终采用Waters C18固相萃取柱开展方法学考察。

2.3 色谱条件的考察

试验对比了Agilent Eclipse SB-C18(150 mm×4.6 mm, 3 μm)和Shimadzu Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm, 3 μm)两种色谱柱,以甲醇或乙腈为有机相,0.15%甲酸溶液为水相对目标化合物进行分离。结果表明,在相同色谱条件(甲醇-0.15%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱)下,杨梅素的信号响应在Inertsil ODS-3色谱柱中高出Agilent Eclipse SB-C18色谱柱8倍,高良姜素在Agilent Eclipse SB-C18色谱柱的分离谱峰存在一定的拖尾现象。以Inertsil ODS-3色谱柱为分析柱对比甲醇和乙腈的分离效果,其中甲醇为有机相时,杨梅素的信号响应强度高出乙腈为有机相时的25倍,高良姜素的信号响应强度高出乙腈为有机相时的4倍。最终采用Inertsil ODS-3色谱柱和甲醇-0.15%甲酸溶液作为分离体系进行梯度洗脱。

色谱分离通常以初始流动相进行定容,对溶液质量浓度为20 μg/L的混合标准溶液测试发现:以甲醇-0.15%甲酸溶液(4∶6,v/v)稀释定容时,杨梅素在放置2 h时信号下降15%,放置4 h时信号下降25%;以甲醇定容时,杨梅素放置4 h时信号下降小于10%,阿魏酸、芦丁色谱峰会出现一定的伸舌现象。实验还表明:以蜂蜜基质溶液定容时,测定化合物的稳定性有效提高,且各化合物谱峰信号较好(见图4);20 h内化合物信号强度下降小于10%。因此选择蜂蜜基质溶液作为线性工作曲线的定容溶液。

图4 蜂蜜加标样品的液相色谱-串联质谱图(加标量20 μg/kg)Fig. 4 LC-MS/MS chromatograms of a spiked honey sample (spiked at 20 μg/kg)

2.4 质谱条件的考察

实验对黄酮类化合物的标准溶液分别进行稀释,采用流动注射的方式在负离子模式下进行母离子全扫描,确定分子离子峰,再分别以待测化合物的分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描。按照欧盟EC/657指令的要求,进行化合物定量确证时必须满足4个识别点(母离子1点,特征子离子1.5点/个),选择两个特征子离子,其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。在负离子模式下以多反应监测模式优化各种质谱参数,获得的最佳质谱条件参见表1。

2.5 基质效应

采用液相色谱-串联质谱法测定药物残留时,样品基质对待测化合物具有增强或抑制效应,从而影响检测结果的准确性。本试验通过对比相同浓度的溶剂工作液和蜂蜜基质加标溶液中各化合物的信号响应强度,计算离子抑制率(离子抑制率(%)=(蜂蜜基质加标溶液的响应强度-溶剂工作液的响应强度)×100%/溶剂工作液的响应强度)来考察基质效应情况[21]。研究表明各化合物在麦卢卡蜂蜜、椴树蜜、洋槐蜜等不同蜂蜜中的基质效应趋势一致,其中定量离子对在杂花蜜中的抑制率如表2所示,可以看出,阿魏酸、桑黄素、柚皮素、山柰酚和白杨素存在较为明显的基质抑制效应(离子抑制率为-26.7%～-42.7%),杨梅素和槲皮素存在较为明显的基质增强效应(离子抑制率为68.1%和43.1%)。因此,试验采用空白蜂蜜(指不含目标化合物的市售蜂蜜)基质溶液对混合标准工作液进行稀释获得线性工作曲线进行定量计算,来降低蜂蜜基质效应的影响,同时提高化合物的稳定性和检测方法的准确性。

2.6 方法的线性关系和定量限

在空白蜂蜜基质溶液中添加混合标准工作液获得基质匹配标准溶液,目标物质量浓度为0、10、20、50、100 μg/L(相当于样品中含目标化合物0、20、40、100、200 μg/kg)。在确定的实验条件下测定其峰面积,以标准品的峰面积Y为纵坐标,以待测物的含量X(μg/kg)为横坐标,绘制各化合物的工作曲线,结果表明,各化合物在10～100 μg/L范围内,线性方程的相关系数(r2)大于0.997。以信噪比大于10确定方法的定量限为20 μg/kg。

2.7 方法回收率及精密度试验

在蜂蜜样品中对目标化合物进行3个水平20、40、100 μg/kg的添加回收试验,每个浓度水平取6个平行样,采用外标法定量,结果如表3所示,方法的回收率为64.5%～113%,相对标准偏差为1.4%～14.5%。符合GB/T 27404-2008的质量控制要求。

表 2 蜂蜜基质对目标化合物的基质效应(n=3)

Mass concentration: 20 μg/L.

表 3 蜂蜜样品中3个加标水平下目标物的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

表 3 (续)

2.8 实际样品检测

应用本方法对22个蜂蜜样品(新西兰麦卢卡蜂蜜8个,新西兰其他蜜源蜂蜜5个,俄罗斯蜂蜜3个(均为椴树蜜),中国蜂蜜6个(椴树蜜1个,洋槐蜜2个,杂花蜜3个))进行检测。结果(见表4)表明,麦卢卡蜂蜜和新西兰其他蜜源蜂蜜的槲皮素、柚皮素、木犀草素、异鼠李素、松属素、白杨素和高良姜素高于在俄罗斯和中国的椴树蜜、洋槐蜜或杂花蜜中的含量。因此,对蜂蜜中黄酮类化合物的含量测定对确定新西兰产地的蜂蜜具有辅助作用。

表 4 蜂蜜样品中黄酮类化合物的含量

3 结论

本文通过使用酸性溶液稀释,C18固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱法检测,外标法定量,实现了对蜂蜜中芦丁、杨梅素、桑黄素、槲皮素、柚皮素、橙皮素、木犀草素、染料木素、山柰酚、异鼠李素、芹菜素、松属素、汉黄芩素、白杨素、高良姜素、芫花素和阿魏酸17种化合物含量的同时测定。该方法具有试验样品用量少,试剂用量少,实验用时短等特点。适合批量、快速检测蜂蜜样品中黄酮类化合物和阿魏酸的含量,对提升蜂蜜蜜源的识别具有重要的辅助作用。