磁性氧化石墨烯的制备及其在环境水样中7种内分泌干扰物检测中的应用

郭菁豪, 童裳伦

(浙江大学环境与资源学院, 浙江 杭州 310058)

随着市政污水和养殖废水的排放,人体和动物排泄物及残留动物饲料中的雌酮、雌二醇、雌三醇等雌激素进入环境水体[1],诱导鱼类性别比例发生变化,使鱼类种群的繁殖能力下降[2],对生物甚至人类的繁衍产生影响。乙炔基雌二醇等由人工合成的激素被用于避孕[3],更年期的激素替代疗法中也会用到人工合成的雌激素。双酚A等重要的化工原料也被发现具有内分泌干扰效应[4],随生产过程中产生的废水进入环境,对环境和人体健康产生威胁。这些天然或人工合成的化合物在环境中的浓度处于痕量水平时,就会对生物和人体的内分泌系统产生干扰,被统称为环境内分泌干扰物(EDCs)。为了了解环境中EDCs的污染情况并为相关政策法规的制定提供数据支撑,开发测定水体中各EDCs浓度的方法具有重要意义。

EDCs分析方法已有高效液相色谱法、气相色谱法、生物检测法和毛细管电泳法等,其中最常用的是高效液相色谱或气相色谱与质谱的联用[5-7]。这种组合具有良好的分离性能且灵敏度高,但存在仪器昂贵、测定成本高等缺点。磁固相萃取(MSPE)是近年来快速发展起来的一种样品前处理方法[8-10]。该处理技术操作简便,材料易于制备且易于分散与分离[11]。石墨烯材料具有优秀的吸附性能[12],氧化石墨烯表面基团的存在使其易于修饰[13],非常适合用来制备磁固相萃取材料[14-16]。季翔等[17]用十二胺修饰石墨烯得到了氨基化的氧化石墨烯(A-GO),将其与尼龙6熔融共混以提高其力学性能。参考十二胺改性石墨烯的制备方法[18],本研究将氧化石墨烯进行磁化,得到磁性氧化石墨烯(magnetic graphene oxide, MGO)。为进一步提高材料对目标EDCs的萃取效率,用十二胺(dodecylamine, DDA)对磁性石墨烯进行修饰。将得到的磁固相萃取材料用于环境水样中7种EDCs测定的样品前处理。采用十二胺对磁性石墨烯进行修饰可增加磁性石墨烯表面的疏水性,而这7种内分泌干扰物是强疏水性物质,根据相似相溶原理,可以改善改性磁性石墨烯对这7种内分泌干扰物的吸附性能,从而提高磁固相萃取材料对目标分析物的萃取效率。将磁固相萃取与HPLC-UV结合,测定环境样品中的EDCs浓度。该法简便快速,富集高效,可实现常规仪器分析,分析成本较低。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nicolet AVA TAR370傅里叶红外光谱仪(美国Nicolet公司); X-pert Power X射线衍射仪(荷兰PANalytical B. V.公司); MPMS-XL-5低温磁场测试(美国量子设计仪器公司); Agilent 1200高效液相色谱系统(美国Agilent公司)。

雌三醇、双酚A、β-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、雌酮、己烷雌酚和雄烯二酮均购于美国Sigma公司,纯度在98%以上。水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)、氨水、浓硫酸、硝酸钠、盐酸、乙醇、丙酮、乙酸、石墨粉均购于国药集团化学试剂有限公司,其中石墨粉纯度为CP级,其余均为AR级。高锰酸钾购于济南萧试化工有限公司,双氧水购于杭州高晶精细化工有限公司,纯度均为AR级。十二胺、氯化亚铁、甲醇和乙腈购于阿拉丁试剂(上海)有限公司,其中十二烷胺和氯化亚铁为AR级,甲醇和乙腈均为色谱级。

1.2 MGO-DDA材料的制备

在冰水浴中将23 mL浓H2SO4、1 g碳粉和0.5 g NaNO3搅拌0.5～1 h,使其充分混合均匀;缓慢加入3 g KMnO4,将温度调节至10～15 ℃,搅拌0.5～1 h;升温至35 ℃,继续搅拌5 h后再加入3 g KMnO4, 35 ℃下继续搅拌12 h;加入140 mL超纯水搅拌30 min,然后加入1.0 mL 30% H2O2,得到亮黄色溶液,终止反应。将反应得到的溶液在8 000 r/min的转速下离心,用200 mL 30%盐酸和超纯水将其反复清洗至上清液的pH为4～5为止,收集下层沉淀,置于30 ℃真空干燥箱中干燥24 h,得到GO。

称取0.3 g GO固体溶于100 mL超纯水中,超声1 h得到分散均匀的黄色GO溶液;取0.01 mol FeCl2·4H2O与0.02 mol FeCl3·6H2O溶于10 mL超纯水中,超声10 min,通氮气30 min后将其逐滴加入到GO溶液中,在氮气气氛保护下搅拌2 h;将体系升温至65 ℃,以10滴/min的速度加入28%的氨水,将体系pH调节至11,搅拌2 h。反应停止后,收集得到黑色沉淀,用乙醇和超纯水进行多次洗涤,然后将其置于40 ℃真空干燥箱中干燥12 h,得到MGO。

称取0.4 g按照上述方法合成的MGO,分散于10 mL超纯水中。取0.3 g DDA溶于10 mL乙醇中,将MGO和DDA两种溶液在锥形瓶中混合,室温下搅拌20 h。得到的固体用乙醇、超纯水和丙酮反复洗涤后,置于40 ℃真空干燥箱中干燥,即可得到MGO-DDA。

1.3 磁固相萃取实验

称取80 mg MGO-DDA加入200 mL待测水样中,将样品瓶置于转速200 r/min的恒温振荡器中振荡摇匀30 min后取出,置于外加磁场中,待吸附了EDCs的MGO-DDA与水样分离完全后,将上清液倒出。用不多于50 mL的超纯水将MGO-DDA转移至50 mL烧杯中,在外加磁场作用下将MGO-DDA与水分离,弃去上清液后放置片刻。依次加入5 mL丙酮与5 mL含1%乙酸的丙酮将EDCs从MGO-DDA上洗脱下来,收集洗脱液,缓慢氮吹至干,最后加入乙腈和水的混合液(体积比57∶43),定容至0.5 mL,经0.22 μm微孔滤膜过滤后用于HPLC分析。

环境水样采集后先用0.45 μm的混合纤维素酯滤膜过滤,除去水样中悬浮杂质和微生物,然后在4 ℃下避光保存,用于样品分析。对于基质复杂的环境水样,如医院排放的废水,在MSPE过程中,将净化溶剂从超纯水改为甲醇和水(体积比1∶1)的混合溶液,以去除杂质干扰。

图2 (a)MGO和MGO-DDA的傅里叶红外光谱图和(b)MGO-DDA的磁滞回线Fig. 2 (a) FTIR spectrum of MGO and MGO-DDA and (b) the magnetic hysteresis loop of MGO-DDA

1.4 液相色谱条件

HPLC分析所采用的色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),温度为35 ℃,检测波长为230 nm,进样体积20 μL,流动相为乙腈和水(体积比57∶43),流速0.7 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 MGO-DDA材料的表征

用XRD表征合成的MGO-DDA材料,结果如图1所示。2θ=30.18°(220)、35.56°(311)、42.86°(400)、57.16°(511)、62.92°(440)处的峰与Fe3O4标准卡片(JCPDS card No.19-0629)一致,这表明MGO-DDA材料中存在磁性组分Fe3O4。

图1 MGO-DDA材料的X射线衍射图及与Fe3O4准卡片的对比Fig. 1 XRD spectrum of the synthesized MGO-DDA and the comparison with standard JCPDS card of Fe3O4 MGO: magnetic graphene oxide; DDA: dodecylamine; JCPDS: Joint Committee on Powder Diffraction Standards.

对合成的MGO和MGO-DDA进行FTIR表征,结果如图2a所示。MGO的FTIR图谱中,3 379 cm-1处的宽峰为-COOH中的O-H键,1 633 cm-1处的峰为芳香环中的C=C键伸缩振动所致,1 775 cm-1处的峰为羧基中C=O键的吸收峰,峰1 405 cm-1也归属于羧基-COOH,峰1 162 cm-1为环氧基中的C-O键伸缩振动所致,峰566 cm-1则归属于Fe-O键。从MGO-DDA的FTIR图谱可以看出,1 775 cm-1和1 405 cm-1处的峰消失,说明-COOH与-NH2发生了反应,表明DDA成功修饰在MGO表面。MGO-DDA材料的磁滞回线如图2b所示,结果表明合成的MGO-DDA材料具有超顺磁性,其饱和磁化强度为30.91 emu/g,足以在外加磁场作用下从200 mL水样中分离回收。

图3 MGO-DDA中MGO和DDA质量比对EDCs萃取效率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of MGO/DDA mass ratios in MGO-DDA on the extraction efficiencies of EDCs (n=3) EDCs: endocrine-disrupting chemicals; E1: estrone; E2: β-estradiol; E3: estriol; EE2: 17α-ethynylestradiol; HEX: hexoestrol; AND: androstendione; BPA: bisphenol A.

2.2 磁固相萃取条件的优化

以200 mL超纯水配制水样,各目标分析物浓度均为5.0×10-8mol/L。将合成的MGO和MGO-DDA分别作为吸附剂,对水样中的EDCs进行磁固相萃取,7种目标物的回收率如图3所示。修饰了DDA的磁石墨烯纳米材料对目标物的吸附效果明显好于MGO, 7种EDCs的回收率分布在74.47%～91.32%之间。这是由于DDA的修饰增强了MGO表面的疏水性,使疏水性的目标物EDCs更易吸附在MGO-DDA材料表面。MGO-DDA材料中MGO/DDA组分的变化对EDCs回收率的影响如图3所示。MGO-DDA材料合成过程中,当MGO与DDA的质量比为1∶1.5、1∶0.75和1∶0.5时,EDCs的回收率无明显的变化,表明DDA的修饰量已满足需求,材料合成时MGO与DDA的质量比选择1∶0.75。考察了MGO-DDA材料用量对于200 mL水样磁固相萃取的影响,EDCs回收率的变化情况如图4所示。80 mg MGO-DDA材料可以满足EDCs的磁固相萃取需求。

图4 MGO-DDA材料用量对EDCs萃取效率的影响(n=3)Fig. 4 Effect of the dosage of MGO-DDA on the extraction efficiencies of EDCs (n=3)

磁固相萃取过程中,水样的pH、吸附时间、洗脱液的种类和体积都会对萃取效率产生影响,图5显示了不同的萃取条件对7种目标分析物萃取效率的影响。实验表明,水样的pH在3～9之间变化时,MGO-DDA对EDCs的萃取效率不会受到影响。MGO-DDA材料吸附时间为20 min时,MGO-DDA对目标分析物有较好的吸附效果。洗脱液采用四氢呋喃、乙酸乙酯和氯仿时,MGO-DDA易发生团聚,不能与洗脱溶剂充分接触;使用甲醇或乙腈进行洗脱时,洗脱效果不如丙酮;在丙酮中加入一定量的乙酸,回收效果进一步提高;丙酮中乙酸含量为1%与5%时,洗脱效果无太大的差异。含1%乙酸的丙酮被用作第二次洗脱的洗脱剂,丙酮作为第一次洗脱的洗脱剂,两次洗脱可以达到理想的洗脱效果。洗脱剂的体积为2、4、6、8 mL时,随着洗脱液体积的增大,EDCs的回收效果逐步提高。为快速富集和充分洗脱目标分析物,磁固相萃取过程中,吸附时间选择20 min,洗脱过程中先用5 mL丙酮进行一次洗脱,再用5 mL含1%乙酸的丙酮进行二次洗脱。

2.3 方法的线性范围与检出限

在最佳的磁固相萃取条件和液相色谱条件下,MSPE-HPLC-UVD方法的线性范围和检出限如表1所示。通过MSPE 400倍的富集,EDCs的检出限低至0.10～0.23 nmol/L,在1.0～100.0 nmol/L的浓度范围内呈良好的线性关系,7种EDCs的线性相关系数均大于0.999。同时进行了精密度试验,同一天内重复5次测定的保留时间和回收率的日内RSD,以及重复5天得到的日间RSD均小于5%。

2.4 环境样品的测定

分别采集了杭州某医院的废水样品与杭州某湖水样品,水样用滤膜过滤,去除其中的悬浮杂质,然后用MGO-DDA材料进行MSPE处理,最后用HPLC-UV测定,采集的水样中均未检出7种EDCs。

表 1 方法的线性范围与检出限

y: peak area;x: concentration, nmol/L.

图6 (a)标准溶液(0.2 μmol/L)与加标50.0 nmol/L的(b)废水和(c)湖水样品的色谱图Fig. 6 Chromatograms of (a) standard solution (0.2 μmol/L) and spiked samples of (b) sewage water and (c) lake water at 50.0 nmol/L

在采集的废水和湖水样品中进行2个不同浓度水平(5.0、50.0 nmol/L)的加标,对加标的水样用上述同样的步骤进行样品处理,最后用HPLC-UV进行测定,标样与加标废水与湖水水样的色谱图见图6。7种目标分析物EDCs的回收率见表2,加标废水样品的EDCs回收率在73.9%～112.9%之间,相对标准偏差在1.3%～11.8%之间;加标湖水样品的EDCs回收率在74.9%～114.7%之间,相对标准偏差在0.7%～5.6%之间。

表 2 水样中EDCs的加标回收率

ND: not detected.

3 结论

本研究合成了一种十二胺修饰的磁性氧化石墨烯材料,并结合高效液相色谱-紫外检测建立了一种对环境水样中7种内分泌干扰物的分析方法,并将其应用于环境水样中内分泌干扰物的测定,取得令人满意的结果。该法操作简便,快速,富集高效,可灵敏检测环境样品中的内分泌干扰物,有助于在普通实验室用低成本与常规仪器对环境样品中内分泌干扰物进行分析研究。