小檗碱对葡萄糖诱导的HEPG2细胞功能的调节机制

李 威 张 旭 赵芳园 匡洪影 刘婷婷

近年来由于人们生活习惯的变化，糖尿病发生率逐年增加，已经成为危害健康的主要疾病之一[1]。糖尿病患者较高的血糖水平对肝功能有重要的影响，在2型糖尿病患者中非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发生率高达34%～74%[2]。较高的血糖水平可能导致肝脏细胞中活性氧簇水平的升高及炎性因子表达水平的异常，从而引起肝纤维化的发生[3]。降低高血糖对肝细胞功能的影响对提高糖尿病患者生活质量有重要意义。

中药黄连是中医治疗肝病的常用药,而小檗碱是黄连的主要有效成分之一，临床和实验研究均发现小檗碱具有明确的降糖、调脂作用[4,5]。因此笔者推测，小檗碱可能对由高血糖造成的肝细胞功能异常有治疗作用。本研究采用小檗碱处理经高浓度葡萄糖诱导的HEPG2细胞，观察小檗碱作用后细胞的活力、脂代谢能力、氧化应激水平及炎性因子表达水平的变化，探讨小檗碱对高浓度葡萄糖诱导的体外培养HEPG2细胞功能的调节机制。

材料与方法

1.实验材料:实验用人源肝脏HEPG2细胞系购自上海继和生物科技有限公司，培养于含10% FBS的1640培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。48h换液1次，2～3天传代1次，待细胞稳定生长后用于后续研究。

2.药品及试剂：实验用小檗碱(上海源叶生物公司，批号：B21379)、葡萄糖(美国Sigma公司，批号：G7021-100G)、油酸钠(美国Sigma公司，批号：Q7501-10G)、尼罗红(美国Sigma公司，批号：72485)、细胞活性氧检测试剂盒(中国碧云天公司，批号：S0033)、IL-6检测试剂盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批号：DECO0291]、TNF-α检测试剂盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批号：DECO0038]、PAI-1检测试剂盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批号：DECO1754]、SREBP-1C抗体(英国Abcam公司，批号：ab28481)、FAS(英国Abcam公司，批号：ab22759)、SCD(英国Abcam公司，批号：ab39969)、AMPK(英国Abcam公司，批号：ab 3759)、P-AMPK(美国Cell signaling公司，批号：500815)、ACC(英国Abcam公司，批号：ab 72046)、P-ACC(ser79)(美国Cell signaling公司，批号：118185)、ACTINβ抗体(美国Santa Cruz公司，批号：sc-70319)。

3.实验主要仪器：M7000荧光显微镜(美国Evos公司)；LC480实时定量PCR仪(美国Roch公司)；ELX800全自动酶标仪(美国Biotek公司)；凝GelDoc EZ胶成像系统(美国Biored公司)。

4.小檗碱药物作用浓度的确定:正式实验前，使用96孔板培养HEPG2细胞待细胞铺满板底后，按照浓度梯度分别向培养液中加入终浓度为0、10、20、40、80、160μmol/L的小檗碱，采用CCK8法检测不同浓度小檗碱作用24h后细胞活力变化，使用GraphPad Prism 7软件计算得到小檗碱培养HEPG2细胞24h的IC50值为71.21μmol/L。为了在不影响细胞正常生长的情况下研究小檗碱的药效机制，在后续研究中以小檗碱IC50浓度的50%即35μmol/L作为小檗碱的最高作用浓度。

5.实验分组及药物处理:体外培养的HEPG2细胞随机分为5组，即对照组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组。对照组为不加葡萄糖及小檗碱的正常细胞，其余4组参照文献[6]，均加入终浓度为25mmol/L的葡萄糖。高剂量组细胞在加入葡萄糖的同时还加入终浓度为35μmol/L(50% IC50)的小檗碱，并按照小檗碱终浓度50%递减的原则设立中剂量组(小檗碱终浓度18μmol/L)及低剂量组(小檗碱终浓度9μmol/L)。各组细胞培养24h后，收集细胞用于后续检测。

6.体外培养HEPG2细胞脂代谢能力检测：各组部分细胞在培养液中加入终浓度为200μmol/L油酸钠， 24h培养结束后，使用终浓度为0.5μg/ml的尼罗红对细胞内的脂类物质染色30min，部分细胞经Hochest33342复染，于荧光显微镜下对细胞590nm荧光强度进行拍照比较；剩余细胞经消化收集后使用流式细胞仪检测细胞内590nm红色荧光强度。

7.体外培养HEPG2细胞活性氧簇水平检测：细胞活性氧检测利用DCFH-DA探针对细胞内ROS进行标记。细胞终止培养后加入0.5ml 10μmol/L的DCFH-DA探针，于37℃下孵育45min，部分细胞经Hochest33342复染后对530nm绿色荧光强度进行拍照比较；其余细胞经消化收集，使用流式细胞仪检测525nm细胞荧光强度。

8.细胞内炎性因子表达水平检测：各组细胞培养结束后，使用RIPA裂解液冰浴状态下裂解细胞，收集蛋白裂解液，经BCA法测定总蛋白浓度后，采用ELISA试剂盒按照说明书对样本中相应因子浓度进行检测，得到的结果与样本总蛋白浓度做比值后则为单位质量细胞中炎性相关因子IL-6、TNF-α及PAI-1的表达水平。

9.实时定量PCR：各组细胞在培养结束后使用Trizol法抽提细胞内总RNA，使用反转录酶对mRNA进行反转录后，使用SYBR Green染料法及LC480实时定量荧光PCR仪对目标基因进行扩增，采用2-ΔΔCT法计算目标基因的相对表达水平，各基因引物序列详见表1。

10.蛋白印迹实验:各组细胞在药物处理完成后使用RIPA裂解液冰浴状态下裂解，按每组每个指标50μg总蛋白的标准经电泳转印过程将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上，经相应抗体孵育后加入ECL发光液，使用凝胶成像系统对进行放射自显影检测，所获得的图像使用软件分析密度与面积，目标蛋白的相对相对表达水平=目标基因密度×面积/同组ACTINβ密度×面积。

表1 引物序列

结 果

1.小檗碱对HEPG2细胞脂肪代谢功能的影响:用尼罗红染色的方法检测细胞内脂类物质的残留水平的结果表明，葡萄糖诱导后的HEPG2细胞中脂类物质蓄积水平显著上升。流式细胞仪检测结果也表明，与对照组比较，模型组细胞红色荧光强度显著增强(对照组3734.33±191.98，模型组27836.00±1716.34，P<0.01)。而小檗碱能以剂量依赖方式降低细胞内脂类物质水平，随着小檗碱终浓度的提高细胞内红色荧光强度逐渐降低(图1)，且与模型组比较，各浓度小檗碱作用后细胞荧光强度的变化差异均有统计学意义(低剂量组16049.33±907.52，P<0.01；中剂量组11717.00±182.79，P<0.01；高剂量组4922.33±161.57，P<0.01)。

图1、HEPG2细胞尼罗红染色结果及流式细胞检测直方图葡萄糖诱导后与对照组比较，模型组细胞尼罗红染色荧光强度增加，流式细胞仪检测结果峰明显右移；随着小檗碱浓度的增加尼罗红染色后的荧光强度逐渐降低，流式细胞仪检测结果峰值与模型组比较逐渐左移

2.小檗碱对HEPG2细胞脂肪代谢相关因子表达水平的影响:各组细胞中脂代谢相关关键因子的mRNA及蛋白表达水平的检测结果表明，与对照组比较，模型组细胞中胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)及脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达水平显著升高而硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)mRNA的表达水平显著降低；小檗碱以剂量依赖方式降低模型细胞中SREBP-1C及FAS mRNA的表达水平同时提高了SCD mRNA的表达水平，在中剂量组及高剂量组中表现的极为显著(图2A)。与对照组比较，模型组细胞中SREBP-1C及FAS的蛋白表达水平显著升高而SCD蛋白表达水平显著降低(图2B)。小檗碱以剂量依赖的方式显著降低模型组细胞中SREBP-1C蛋白表达水平，同时显著提高葡萄糖诱导的HEPG2细胞中SCD的蛋白表达水平，但小檗碱对HEPG2细胞中FAS蛋白表达水平的影响未发现明显的剂量依赖特征(图2C)。

图2 脂代谢相关因子mRNA及蛋白表达水平检测A.脂代谢关键因子mRNA表达水平检测；B.关键因子蛋白表达水平检测；C.蛋白表达水平灰度分析;与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3.小檗碱对HEPG2细胞ROS水平的影响：依据 “二次打击学说”，肝细胞脂类物质沉积可能影响细胞内氧化应激水平及活性氧簇(ROS)的代谢平衡。本研究对各组细胞ROS的水平的检测结果表明，经葡萄糖诱导后，体外培养的HEPG2细胞活性氧簇水平显著上升，与对照组比较，模型组细胞DCFH-DA染色后流式细胞仪检测到的荧光强度显著增强(对照组1071.00±53.00，模型组5609.50±231.51，P<0.01)。小檗碱以计量依赖的方式降低细胞内的ROS水平，随着小檗碱终浓度的提高细胞内活性氧簇水平逐渐降低，细胞平均荧光强度逐渐下降，与模型组比较各浓度小檗碱作用后流式细胞仪检测到的细胞荧光强度差异均有统计学意义(低剂量组4460.53±208.57，P<0.01；中剂量组2708.00±33.12，P<0.01；高剂量组1309.82±170.50，P<0.01)，详见图3。

图3 HEPG2细胞内ROS水平检测及流式细胞直方图(DCFH-DA染色，×100)葡萄糖诱导后与对照组比较，模型组细胞绿色荧光强度增加，流式细胞仪检测结果峰明显右移；随着小檗碱浓度的增加绿色荧光强度逐渐降低，流式细胞仪检测结果峰值与模型组比较逐渐左移

4.小檗碱对HEPG2细胞氧化应激相关因子表达水平的影响:各组细胞中氧化应激相关的关键因子mRNA表达水平的检测结果表明，细胞内抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSR)及过氧化氢酶(CAT)的mRNA表达水平在葡萄糖诱导后均显著下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而小檗碱作用后SOD、GSR及CAT的mRNA表达水平均显著上调，并且随着小檗碱终浓度的提高上调的幅度愈加明显(图4)。

图4 细胞内抗氧化因子mRNA表达水平A.SOD;B.GSR;C.CAT；与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

5.小檗碱对HEPG2细胞炎性因子表达水平的影响：模型组HEPG2细胞中白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)的水平较对照组显著升高(P<0.01)。而小檗碱对这种高浓度葡萄糖造成的炎性因子表达的异常有明显的抑制作用。中剂量及高剂量的小檗碱能够显著降低模型组细胞中IL-6的表达水平；同时高中低剂量的小檗碱均能够显著降低TNF-α的表达水平；而对细胞内PAI-1表达水平的显著抑制作用则只在高剂量小檗碱作用时被观察到(表2)。

表2 细胞内炎性因子表达水平

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,ΔP<0.01

6.小檗碱对HEPG2细胞AMPK信号通路的调节:与对照组比较，模型组细胞AMPK因子mRNA的表达水平没有显著变化而ACC因子mRNA的表达水平则显著降低。与模型组比较，不同终浓度的小檗碱均能够显著提高AMPK及ACC mRNA的表达水平(图5A)。蛋白印迹法检测结果表明，模型组细胞中AMPK、P-AMPK、ACC及P-ACC的表达水平与空白组比较，差异均无统计学意义(图5B)。与模型组比较，高中低浓度的小檗碱均能够显著提高AMPK及ACC的蛋白表达水平及这两个关键因子的蛋白磷酸化水平，说明小檗碱对体外培养的HEPG2细胞内的AMPK信号通路有明确的激活作用(图5C)。

图5 AMPK信号通路因子mRNA及蛋白表达A.AMPK信号通路关键因子mRNA表达水平检测；B.关键因子蛋白表达水平检测；C.蛋白表达水平灰度分析。与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

讨 论

在2型糖尿病的并发症中，尽管非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)流行比例达34%～74%，但由于其症状隐蔽，长期以来一直为人们所忽视[7]。临床研究发现，小檗碱不仅能改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗、降低血糖并且对脂质代谢紊乱也具有调节作用[8]。而本研究结果表明，小檗碱能通过调节细胞内脂代谢相关因子SREBP-1、SCD及FAS的表达水平进而显著降低高浓度葡萄糖所引起的细胞内脂类物质积累。肝细胞内的脂肪沉积不仅有影响肝细胞的正常代谢功能还会引起细胞氧化应激水平的变化，由于脂类物质积累所造成的肝细胞内ROS水平的异常升高可能造成肝细胞的氧化应激损伤[9]。本研究发现，小檗碱能够显著降低细胞内的ROS水平，通过激活细胞内抗氧化因子的表达水平保护细胞免于高浓度葡萄糖造成的氧化应激损伤，说明小檗碱具有一定的抗氧化功能。

由于高血糖引起的非酒精性肝损伤及肝脏细胞的脂类物质沉积不仅对肝脏功能产生影响，还可能导致肝脏的纤维化等不可逆的病理性改变，在这一过程中肝脏自身分泌的炎性因子起到重要的作用[10]。小檗碱能够降低非酒精性肝损伤模型大鼠炎性因子水平，保护模型动物肝脏免于纤维化损伤[11,12]。同样在本研究中，小檗碱也能够显著降低葡萄糖诱导后HEPG2细胞内源性的炎性因子表达水平，提示小檗碱很可能通过调节肝细胞炎性因子的表达来缓解非酒精性肝损伤造成的肝脏纤维化改变。

小檗碱对AMPK信号通路有显著的激活作用，AMPK信号通路不仅与细胞的糖脂代谢关系密切，还参与细胞氧化应激及炎性因子表达的调节。AMPK通路的激活能够通过抑制肝脏细胞SREBP-1C因子的表达水平抑制肝脏组织脂肪变性的发生，同时在心肌细胞中二甲双胍通过激活AMPK信号通路上调心肌细胞抗氧化因子的表达水平抵抗缺血-再灌注对心脏的损伤[13,14]。本研究发现，小檗碱对体外培养的HEPG2细胞AMPK信号通路有显著的激活作用，随着小檗碱终浓度的提高，AMPK及ACC的核酸、蛋白及磷酸化蛋白的表达水平显著上升。AMPK信号通路的激活，高浓度葡萄糖诱导的HEPG2细胞的脂类物质代谢能力、细胞内活性氧簇水平及异常的炎性因子表达水平的异常现象都有所缓解，并且这种变化与小檗碱终浓度的变化及AMPK信号通路的活化程度密切相关。

综上所述，本研究中体外培养HEPG2细胞经过高浓度葡萄糖诱导，在脂类物质代谢、细胞氧化应激水平及炎性因子分泌水平等方面都出现了类似非酒精性肝损伤的病理表现。小檗碱通过剂量依赖的方式，激活AMPK信号通路缓解了由于体外培养的HEPG2细胞高浓度葡萄糖诱导造成的功能异常。基于AMPK信号通路对细胞氧化应激水平及脂代谢功能的调节作用，推测AMPK信号通路很可能是小檗碱缓解非酒精性肝损伤临床表征的药理作用机制，而对小檗碱治疗非酒精性肝损伤药理机制的深入研究，对拓展中医药治疗肝脏疾病方面的应用具有积极的意义。