野生型p53诱导的磷酸酶1在细胞稳态调节中作用的研究进展

闫峰，罗玉敏，朱玲玲，范明2,3,*

(1.首都医科大学宣武医院脑血管病研究室，北京 100052； 2.首都医科大学脑重大疾病研究中心，北京 100069；3.北京脑重大疾病研究院，北京 100069； 4.中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，北京 100029)

野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)是蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase type 2C，PP2C)激酶家族中的一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其由PPM1D基因编码，位于染色体的17q22-23位，在干细胞、中性粒细胞、骨髓来源的巨噬细胞和T淋巴细胞广泛表达。与众多的磷酸酶通过磷酸化或者去磷酸化发挥催化作用不同，目前的研究还没有报道Wip1的活性可以通过翻译后的修饰进行调节，大家公认的对于Wip1的调节方式主要是通过其表达量的变化而实现的[1]。

顾名思义，对于Wip1最早的研究是发现其在机体遭受电离辐射后，可以作为p53的一个靶基因参与损伤应答，随着研究的深入以及研究方向的扩大，研究人员发现应激状态下Wip1还可以被多种刺激诱导表达，包括电离辐射、紫外线照射、过氧化氢、炎症因子等刺激可以使Wip1可以直接绑定到多种关键的信号分子上，使其靶分子去磷酸化从而发挥抗凋亡、细胞周期停滞和DNA损伤修复的作用，对细胞增殖、细胞周期、衰老、应激反应细胞的凋亡和自噬进行关键的调节；而在正常状态下，Wip1也起着调节DNA损伤修复的作用，使细胞可以正常的新陈代谢，使机体维持在一个正常的平衡状态下。而且在众多疾病模型的研究中发现了Wip1在DNA损伤应答、肿瘤增殖调节以及免疫反应中都具有非常的重要作用[2-3]。目前报道的Wip1下游靶基因主要包括p53、ATM、p38MAPK、NF-κB、mTOR等，通常我们认为Wip1作为负反馈环路中的一个重要分子参与到细胞稳态的调节中。Wip1被诱导后负向调节DNA损伤相关信号通路，降低p53的活性，使很多DNA损伤修复的相关蛋白表达增加，抑制细胞凋亡的发生[4]。在本篇综述中，将主要对其在肿瘤发生及炎症反应中的调控作用进行综述。

1 Wip1在抗凋亡中的作用

肿瘤作为威胁人类健康的一类主要疾病，对其研究也愈发深入。在近些年中的研究中发现在多种人类的肿瘤细胞中都出现了Wip1过表达的现象，包括直结肠癌、乳腺癌、胃癌等[5-7]。细胞的凋亡在维持DNA正常复制和DNA正常传递给子代的过程中发挥着重要的作用，它可以避免将发生突变的、有害的DNA传递给子代。而在肿瘤的形成过程中，往往会出现细胞凋亡功能的异常，进而促进了肿瘤的增殖。p53作为一个重要的调控凋亡的分子，已有大量研究证明其在多种肿瘤细胞中都发生了突变。而Wip1作为p53的负反馈调节凋亡过程的典型分子，他可以通过直接与p53相互作用，使其去磷酸化，进而通过影响上下游相关蛋白的表达起到抑制凋亡，促进细胞存活的作用。已有多篇文献报道了Wip1通过影响p53的功能在肿瘤细胞存活中发挥重要作用[8-9]。Yang等[10]在临床工作中发现了在非小细胞肺癌的发生过程中，Wip1调节的p38MAPK/p53/p16通路在其中发挥了重要作用。在人类常见的肿瘤癌细胞系SKOV3中使用Wip1的siRNA可以明显的增加SKOV3细胞的凋亡相关蛋白表达和p38MAPK的磷酸化，有可能成为人类卵巢癌潜在的治疗途径[11]等。与大多数的研究结果都显示p53可以正向调控Wip1的表达不同，有研究显示p53/Wip1/miR-16三者之间存在一个环路，p53可以通过诱导miR16的表达从而抑制Wip1的表达，影响细胞的衰老和凋亡[12]。这个现象既可以说明通过增加miR16的水平而抑制Wip1有可能在抑制肿瘤组织的再生过程中会发挥重要作用，但是同时也说明对于Wip1表达的调控要更加精细的进行。基因表达分析结果显示，包括MMp-9和CXCR4等转移基因在高表达Wip1的成神经管细胞瘤中的表达出现了上调，促进了癌细胞的增殖和侵袭。同时有研究发现，Wip1单独过表达或者与SHH信号通路共同被激活时可以明显的促进成神经管纤维瘤的存活和增殖，这说明Wip1与SHH信号通路间存在着重要的串联通路，此通路可以作为抑制Wip1表达，治疗成神经管细胞瘤的一个可能的方案[13]。

2 Wip1在DNA损伤修复及细胞周期中的作用

众所周知，细胞生命活动的绝大部分时间是处在细胞周期的间期，这个时期是细胞合成DNA和各种酶类的重要时期。如果DNA发生损伤可以迅速阻止细胞周期进程并促进细胞中的DNA修复。有文献报道显示Wip1抑制后可以显著抑制细胞周期，促进G2期停滞期间受损DNA的修复[14]。在另一项癌症候选药物Mdm2拮抗剂的筛选研究中发现抑制Wip1可以影响Mdm2的功能增加细胞的衰老和细胞在G2/M期的积累[15]。以上的研究说明了Wip1在细胞周期调控中的重要作用，也是Wip1影响肿瘤发生的理论基础之一。同时有研究发现在非应激状态下，Wip1介导的细胞周期停滞现象可以增加有丝分裂的成功率，避免细胞因有丝分裂失败造成的死亡，这也为肿瘤细胞逃避有丝分裂检查点创造了条件，客观上促进了肿瘤细胞的增殖[16]。鉴于Wip1在正常细胞以及应激后的重要作用，在合适的时间点对其进行调控显得尤为重要。韩国的研究人员发现，正常细胞有丝分裂的末期APC/Ccdh1可以通过影响Wip1稳定性来调节细胞周期，这对于维持细胞正常的有丝分裂具有重要的意义[17]。即使是在正常的情况下，细胞也是在不断地经受着DNA损伤的挑战，细胞通过复杂的DNA损伤修复机制来不断的修复损伤，从而保证遗传信息的完整和正确。蛋白质的磷酸化在DNA损伤修复复杂的机制中充当着关键的角色。γH2AX是DNA双链损伤和DDR信号通路的一个标签，在DNA损伤的修复过程中发挥了重要作用，它可以招募Mdc1，Rad51等参与损伤修复的分子到DNA双链的损伤处共同参与修复过程。免疫荧光染色发现Wip1可以与γH2AX在染色质共定位，同时生化方面的研究发现Wip1可以使γH2AX去磷酸化从而降低其水平，减少其对于DNA损伤修复元件的募集。在应激状态下，Wip1的缺失会造成γH2AX水平的增加，而过表达Wip1可以降低其水平，且这种影响是以ATM依赖的方式进行的。后续的研究发现Wip1对于γH2AX的作用不止是影响DNA损伤修复元件的募集，并且可以阻止细胞进入G2/M期细胞周期检查点。在肿瘤发展中，γH2AX也发挥着关键作用，更说明了Wip1作用的关键[18]。而在Macurek等[19]的研究中使用先进的实验技术和严格的实验流程细致的观察了Wip1在细胞周期中的动态变化，他们证明了Wip1在细胞周期的G1和S期处在较高的水平，而在有丝分裂期处在较低的水平。其在有丝分裂末期是通过APC/C和其启动子Cdc20控制Wip1泛素依赖的蛋白酶体降解途径降低了Wip1的表达水平。

干细胞作为组织损伤后修复过程中新生细胞的重要来源，越来越受到研究人员的重视，体外培养的干细胞可能作为多种疾病新的治疗手段，使之前无法治愈或预后不良的疾病被攻克成为可能，适度的激活干细胞可以补充受损组织，恢复组织功能；而过度的激活干细胞则有可能带来肿瘤的风险，因此对于其状态的控制至关重要。已经有研究发现在肠癌中Wip1高表达在肠干细胞中，Wip1可能通过抑制干细胞中p53的功能而启动了肠癌的发生[20]。而在对神经干细胞的研究中发现，在Wip1缺失的小鼠脑组织的本应该聚集大量神经干细胞的SVZ区出现明显的神经干细胞减少[21]，这有可能会对神经元损伤后的修复造成一定的影响。有研究发现在造血干细胞中Wip1具有较高的表达水平，但是其表达量随着年龄的增加而减少。与在其他细胞中不同的是，Wip1在造血干细胞中发挥作用一方面通过p53介导，另一方面可以独立于p53通路，通过mTORC1介导的造血干细胞增殖[22]，该实验部分揭示了干细胞衰老的机制。MdmX是一个p53的负反馈调节因子，上调MdmX可以启动负反馈回路，其可以与Mdm2形成复合体，使p53泛素化增加，降低其蛋白水平。由于其对于p53的负反馈作用，MdmX可以在应激状态下调对于DNA损伤的应答，其有可能与Wip1有协同作用，或者二者之间存在着某种联系。研究结果显示Wip1一方面可以直接去磷酸化MdmX的403丝氨酸位点，另一方面以间接方式抑制MdmX342和376位丝氨酸的磷酸化，提高MdmX的水平；过表达Wip1可以减低pS403-MdmX的水平，反过来与Wip1正常组相比，Wip1敲除可以降低MdmX的水平。由此证明了Wip1与MdmX协同作用，降低了p53的功能，促进肿瘤组织的生长[23]。由此可见对于Wip1表达的调控可能会影响到疾病的最终走向。

3 Wip1对细胞炎性反应的调节

近期的多项研究结果显示，Wip1对炎症的调节起着关键作用。对于Wip1在炎症中作用的研究多数实验直接使用LPS刺激后观察模型反应。多项研究已经证实了在炎症反应中具有重要作用的分子—NF-κB是Wip1的一个靶分子。在IL-1或者TNF-α刺激下，过表达或者敲低Wip1可以减少或者增加NF-κB的活性。进一步的研究结果显示Wip1调节NF-κB的活性是通过磷酸化其536位的丝氨酸而实现的，与其抑制分子I-κBα无关；并且不依赖于p38MAPK通路，在使用p38MAPK的抑制剂SB202190后并不能挽救由于Wip1缺失造成的p65的536位丝氨酸水平的升高[24]。而在对噬中性粒细胞的研究中发现，Wip1通过p38MAPK-STAT1通路影响骨髓前体细胞向嗜中性粒细胞的成熟分化，并且此作用是p53非依赖性的[25]，这说明Wip1对于免疫细胞的调节在不同的细胞或者不同的发育阶段所介导的通路是不同的。在一项使用Wip1敲除的动物制作肠缺血再灌注模型的研究中发现相比较于野生动物，Wip1敲除的动物会表现出更为严重的肠缺血再灌注损伤。进一步的研究发现，Wip1的敲除导致肠缺血再灌注后中性粒细胞浸润增加，并且趋化因子CXCL-1、CXCL-2、炎症因子TNF-α、IL-17等促炎物质表达明显增加，并且他们发现缺血再灌注损伤的加重是由于Wip1敲除后中性粒细胞分泌更多的IL-17所引起的。在同时进行的一项临床实验中发现，在活跃期的炎性肠病病人外周血液和肠固有上皮细胞中的Wip1较健康人群均明显下降，平行进行的DSS诱导的小鼠肠炎模型中也得到了相同的结果，而且Wip1敲除的小鼠炎性损伤更加严重[26]，这都可以说明Wip1在肠炎中的重要的抑制作用。

图1 Wip1在调节细胞稳态作用中的靶点及信号通路Figure 1 Targets and signaling pathways of Wip1 in regulating cell homeostasis

越来越多的研究表明，炎症在多种中枢神经系统疾病中起着关键的作用，例如老年痴呆、外伤性脑损伤、高原脑水肿等。有学者观察了Wip1在中枢神经系统炎症反应中的作用。在2013年，Tan等[27]使用尾静脉注射LPS的方法诱导大鼠全身炎症反应后发现脑组织中Wip1的表达水平显著升高，同时他们还观察到星形胶质细胞被明显激活，二者之间存在着一定的联系；而在体外实验中使用siRNA敲低原代培养的星形胶质细胞中的Wip1后可以观察到TNF-α表达水平显著增加。进一步的研究结果显示，Wip1的缺失加重了LPS刺激后血脑屏障的破坏，紧密连接相关蛋白表达下降，除TNF-α外，IL-1β、IL-12和IL-6等促炎因子表达水平明显升高，Sonic hedgehog(SHH)信号通路被Wip1的过表达或者低表达所影响，因此作者认为Wip1缺失导致的促炎因子的升高和SHH信号通路的变化是血脑屏障通透性增加的主要原因[28]。在从视网膜细胞诱导分化的星形胶质细胞离体实验中发现，使用LPS刺激后，Wip1和NF-κB的表达出现了明显的上调并且共同定位在星形胶质细胞中，使用Wip1 siRNA预处理可以增加LPS刺激后NF-κB P65的入核，并且促炎因子释放；而使用抑制剂抑制NF-κB可以明显的降低Wip1在原代星形胶质细胞中的转录。在视神经损伤的动物模型中也发现了同样的现象。视神经损伤后星形胶质细胞中的Wip1的表达明显增加，并且NF-κB p65亚基的磷酸化显著升高，炎症因子释放增多[29]。联系前面的实验NF-κB调节Wip1的表达，说明Wip1与NF-κB之间可能同样存在一个负反馈的环路从而相互影响[30]。本课题组在前期研究中也发现在将腹腔注射LPS的小鼠放置在模拟高原低氧的极端环境中，Wip1的缺失会导致脑组织和外周循环中的炎症因子较野生动物明显升高，并且通过免疫组化的方法发现脑组织中定居的免疫分子小胶质细胞被大量激活，加重了认知和行为功能的损伤，说明Wip1在高原低氧炎症诱导的脑损伤中的重要作用[31]。但之前大量的研究均是使用LPS刺激机体或者细胞所诱导的炎症反应，在病理生理状态下的炎症反应发生机制与LPS刺激后的炎症反应发生机制不完全相同，因此Wip1对于现实病理生理状态下炎症反应的调节还有待进一步研究。

4 总结

虽然近年来对于Wip1在应激后的研究取得了一定的进展，其可以被多种应激刺激诱导表达，并且多种信号通路参与到对其表达的调控中(图1)，但是仍有很多方面需要进行深入的研究。Wip1在不同通路中的调节作用与其时空表达具有密切关系。例如Wip1在正常组织中可以调节细胞的稳态，在一定范围内促进细胞的增殖，但其过表达后会表现出明显致瘤的倾向；另一方面Wip1缺失后导致机体炎症反应的增加，而目前对于炎症反应的研究显示其与机体老化进程有着密切的联系。如何调整Wip1的表达，使其有益的功能最大化，又可以避免肿瘤的形成还存在着巨大的未知。并且目前的研究结果显示Wip1与p53，p38MAPK和NF-κB等分子均构成负反馈环路，其水平的变化会影响多个环路相关蛋白的表达，而受到影响的蛋白发生变化后还会再次作用于Wip1，这种负反馈环路的存在强调了Wip1对于细胞稳态的调节作用，但也对希望将其功能发挥到最大构成了相当大的挑战。研究发现ERα被可以直接绑定到Wip1的启动子区域，从而调节Wip1的表达，在肿瘤中的生长过程中发挥作用，但是研究人员发现单纯过表达Wip1并不会导致肿瘤的发生[32]。因此Wip1可能本身并不是一种直接的致癌基因，而是通过它在多个目标分子上的功能为肿瘤的发展提供了便利。此外现阶段对于Wip1酶活性的研究还有待加强。其本质作为一种酶类，表达量和酶活性的变化均可能对其在病理生理过程中的作用产生巨大的影响。因此对Wip1表达水平及活性的严格控制，对于其在细胞中发挥重要的功能至关重要。一旦解决好这两方面的调控，将Wip1促进细胞增殖的功能发挥出来，使之成为一个有效的药物靶点，可以使目前治疗困难的多种疾病获得巨大的进展。