GFP标记脐带间充质干细胞治疗mdx小鼠的药代动力学研究

庞荣清，朱 慧,2，鄢东海,3，王 强，李自安，王金祥，于倩倩，阮光萍，朱向情，潘兴华*

(1.联勤保障部队第九二〇医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室，昆明 650032；2.延安大学医学院，陕西 延安 716000； 3.巴东县人民医院，湖北 巴东 444300)

由于取材方便、适于规模化生产、细胞增殖活性强等优点，脐带间充质干细胞已经成为再生医学研究最为广泛的种子细胞之一，是一种具有良好发展前景的细胞药物[1]。干细胞具有传统药物所不具备的增殖能力、靶向迁移能力、自分泌能力等生物学特性，是现代药代动力学研究的巨大挑战。显然传统药物的药代动力学评估药物吸收、分布、代谢的体系并不适于细胞药物的评估，监测干细胞在体内的分布和清除才是关键[2]。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记是稳定的体内示踪方法[3]，结合活体成像技术是监测细胞在体内分布的有效手段[4]。

杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一种以骨骼肌、膈肌进行性变性、坏死为主要病理特征的遗传性肌病，在出生男婴中的检出率约为1/3500。由于其家族遗传性的特点，目前尚无有效治疗方法。间充质干细胞具有一定的再生和修复肌肉的作用，是肌营养不良症的潜在治疗药物[5]。本实验室的前期研究已成功分离、扩增和纯化小鼠脐带间充质干细胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cell, mUCMSC)[6]，还从英国引入DMD治疗研究最常用的X-连锁肌萎缩(X-linked muscular dystrophy，mdx)小鼠，采用GFP示踪结合活体成像技术，观察脐带间充质干细胞进入mdx小鼠腹腔后的清除速率和组织靶向性,为脐带间充质干细胞用于肌病治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

经鉴定5只清洁级mdx小鼠，雌性3只，雄性2只，体重22～26 g，确定性别后随机分为实验组(1♂2♀)和对照组(1♂1♀),48周龄(这个年龄已出现明显腓肠肌、膈肌损伤)，由英国牛津大学Davies教授惠赠(动物入境检疫许可证号为AD44010011)，饲养于原成都军区昆明总医院实验动物中心屏障系统环境实验室[SYXK(滇)2015-0011]。经过原成都军区昆明总医院伦理委员会批准开展动物实验研究(审批号：2016011号)。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》、按照3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

C57小鼠脐带间充质干细胞(mUCMSC)来自于作者所在云南省干细胞工程实验室细胞库，即复苏经免疫表型鉴定和诱导分化实验鉴定合格的第三代mUCMSC用于实验研究。Lenti慢病毒载体液为上海吉满生物科技有限公司产品；培养基DMEM/F12、胎牛血清、0.25%EDTA-胰蛋白酶为Hyclone公司产品；80i荧光显微镜为Nikon公司产品。小动物活体成像仪FluorVivo，为环亚生物科技公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 mUCMSC的GFP转染标记

按照前期建立的mUCMSC培养方法[6]，将鉴定合格冻存的第三代mUCMSC快速解冻，移至50 mL离心管内加入生理盐水充分混匀后离心，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬后转移至多个175 cm2培养瓶中静置培养24 h，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)MOI值为150的剂量加入慢病毒载体共培养72 h，在荧光倒置显微镜下观察拍照。消化收集慢病毒载体共培养72 h的mUCMSC，加入生理盐水制成细胞浓度为每毫升1.25×107个的细胞悬液备用。

1.3.2 腹腔注射及活体成像观察

实验组3只mdx小鼠，仰卧位固定，酒精消毒腹壁后将其微微提起，小心穿刺，确保注射器针尖进入腹腔空隙但不进入肠管或其它脏器，每只腹腔一次性注射0.4 mL 生理盐水细胞悬液(含5×106个GFP标记的第三代mUCMSC)，对照组2只mdx小鼠对照仅注射0.4 mL 生理盐水。在移植后1 h、3 h、5 h、24 h、1周用小动物活体成像仪观察小鼠腹壁注射细胞局部和腹腔荧光信号的分布，并确定脐带间充质干细胞的清除速率。

1.3.3 膈肌组织学镜检观察

参照前期建立的方法[7]，活体成像观察结束立即处死实验小鼠切取膈肌，采集每只鼠膈肌的左、中、右3小块，分别置于固定架上滴加包埋剂，固化后每小块膈肌制作冰冻切片，荧光显微镜下观察拍照，计数10倍镜下每个视野内荧光信号点，每小块膈肌计数5个视野，每只鼠左、中、右3小块膈肌共计数15个视野。比较分析实验组和对照组之间荧光信号点数的差异。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 GFP转染标记的mUCMSC

按照最佳MOI值150的剂量加入慢病毒载体与mUCMSC共培养72 h后，荧光显微镜下观察，可见大量贴壁生长细胞呈现明亮的绿色荧光(图1A)。这些散发绿色荧光的mUCMSC，用0.25% trypsin-EDTA消化传代3代，荧光亮度无明显衰减(图1B)。

注：A:GFP标记的mUCMSC；B:传代的GFP标记的mUCMSC。图1 慢病毒载体转染标记的mUCMSCNote. A, mUCMSC-labeled GFP. B, Passaged mUCMSC-labeled GFP.Figure 1 mUCMSC-labeled by GFP lentiviral vector transfection

2.2 体内mUCMSC的分布和降解

0.4 mL生理盐水悬浮的5×106个GFP标记的mUCMSC，一次性注射到mdx小鼠腹腔后1 h、3 h、5 h，在小动物活体成像仪绿色荧光通道下观察到腹壁下注射细胞的部位有明亮的绿色荧光集中分布，只是荧光轮廓不断缩小(图2A、2B、2C)。24 h后荧光强度明显变弱 (图2D)，2只mdx小鼠甚至不能确定轮廓。一周后，所有小鼠腹部均观察不到荧光信号。为进一步观察腹腔内部绿色荧光信号的分布，将mdx小鼠处死后剪开腹壁，暴露整个腹腔脏器，可在小动物活体成像仪绿色荧光通道下观察到腹壁内侧和器官表面有少许荧光点分布(图2E)，而注射未标记GFP的mUCMSC的对照小鼠检测不到典型的明亮绿色荧光的存在(图2F)。为了观察GFP标记的mUCMSC在mdx小鼠体内的降解变化趋势，把实验组(n=3)确定的荧光轮廓测定出平均荧光面积，mUCMSC注射后1 h、3 h、5 h平均荧光面积依次为(36.5±2.3) mm2、(33.8±2.6) mm2、(30.9±3.5) mm2。把确定不了荧光轮廓时和以后的平均荧光面积视为0，就可发现，荧光面积随着细胞注射后的时间延长呈不断缩减的趋势(图2G)，尤其是细胞注射后5 h后呈现快速消减趋势。

注：A:注射后1 h；B:注射后3 h；C:注射后5 h；D:注射后24 h；E:注射后1周(168 h)腹腔内脏；F:对照mdx小鼠；G：变化趋势图。图2 局部注射GFP-mUCMSC后mdx小鼠腹部荧光信号分布及变化趋势分析Note. A, 1 h after injection. B, 3 h after injection. C, 5 h after injection. D, 24 h after injection. E, Abdominal cavity 1 week after injection. F, Control mdx mice. G, Change tendency chart.Figure 2 Fluorescence signal distribution and change tendency analysis in the abdomen of mdx mice after local GFP-mUCMSC injection

2.3 镜检观察膈肌内mUCMSC的分布

注射细胞1周后的mdx小鼠膈肌冰冻切片内，在荧光显微镜下，每只鼠的左、中、右部位均可在膈肌横断面观察到少许绿色荧光信号散在分布(图3A，3A-1,3A-2)，对照组小鼠膈肌横断面观察不到绿色荧光信号(图3B)。按照每个部位5个视野，每只鼠共计数15个视野(n=15)计算，每只鼠膈肌内有(2.9±2.2)个绿色荧光信号，与未注射细胞的对照组有显著差异(P﹤0.05)(图3C)。

注：A：实验组mdx小鼠(合成图)；A-1：GFP；A-2：DAPI；B：对照mdx小鼠；C：比较分析图。*P<0.05图3 注射后1周mdx小鼠膈肌组织内荧光信号分布镜检观察及比较分析Note. A, Experiment group mdx mice(merged). A-1, GFP. A-2, DAPI. B, control mdx mice. C, Comparison analysis chart.*P<0.05Figure 3 Fluorescence signal distribution observed by fluorescence microscope in the diaphragm of mdx mice at 1 week post injection and comparison analysis

3 讨 论

建立稳定可靠的体内示踪技术，是动态监测移植的间充质干细胞在体内的迁移分布、开展间充质干细胞药代动力学研究的前提[8]。本研究显示：按照最佳MOI值150的剂量加入慢病毒载体与mUCMSC共培养，可以成功使mUCMSC转染GFP，在特定波长光照条件下发出绿色荧光，传代3代，荧光亮度不会明显衰减，这暗示GFP转染标记的mUCMSC可用于体内短期示踪。GFP基因转染标记的细胞，在特定波长的光照激发下就会发出绿色荧光[9]，结合活体成像技术，实现了对植入细胞的适时动态观察。

静脉途径给药是间充质干细胞治疗常用的方法，但我们的前期研究发现静脉注射大量间充质干细胞治疗mdx小鼠极易引发小鼠栓塞死亡[7]。腹腔注射法操作简单，不存在引发肺栓塞的危险，而且腹腔注射与静脉注射间充质干细胞的效果没有差别[10-11]，本研究显示：一次性腹腔注射大剂量细胞给腓肠肌、膈肌等肌组织进行性变性坏死的mdx小鼠，1 h后可在注射细胞的腹壁下观察到明亮的绿色荧光集中分布，随后荧光面积逐渐缩小，24 h后荧光面积大幅缩小，荧光强度明显变弱，一周后，腹部观察不到荧光信号，这与人脐带间充质干细胞在裸鼠体内研究的报道类似[12]。为了进一步观察腹腔内部绿色荧光信号的分布，本研究将mdx小鼠处死后剪开腹壁，暴露整个腹腔脏器，可在小动物活体成像仪绿色荧光通道下观察到腹壁内侧和器官表面有少许荧光点分布。这表明：注射到mdx小鼠腹腔内的GFP标记的mUCMSC在24 h之内细胞数量在不断减少或者细胞浓度在不断降低。C57小鼠来源的mUCMSC，转染GFP不会影响其免疫原性低的生物学特性。因此，注射同种异体mUCMSC到与C57小鼠同源的mdx小鼠腹腔，不会很快被mdx小鼠免疫细胞清除，注射到腹腔的细胞在mdx小鼠体内可能存在1周，24 h内腹壁荧光信号大幅减弱的主要原因是细胞浓度降低所致，很有可能与肠管蠕动造成的被动运动有关，也可能是受到全身肌肉损伤而产生的趋化因子的招募作用而形成的主动运动有关。活体成像技术不能观察到注射细胞后1周的mdx小鼠腹腔存在明显荧光时，采用荧光显微镜检测方法还可在mdx小鼠膈肌内观察到荧光信号的存在，表明擅长于整体观察的小动物活体成像仪检测GFP荧光信号的灵敏度远低于擅长于微观观察的荧光显微镜，注射到腹腔的mUCMSC可以进入膈肌，其迁移机制可能与mdx小鼠的损伤膈肌释放的炎症因子的靶向招募有关[13-14]，具体迁移及作用机制有待于进一步深入研究。