低温微萃取-GCMS/MS联用技术检测食用油中20种持久性污染物

刘笑笑，张菁菁, 李晨曦，吴福祥，姬良亮，丁辉, 彭涛

(兰州市食品药品检验所, 甘肃 兰州，740050)

多环芳烃(polycylic aromatic hydrocarbon, PAHs)和塑化剂(plasticizer PAEs)属于持久性环境有机污染物，具有高毒性、易迁移性、稳定性和生物累积性等特点[1-2]，大量存在于水、土壤、蔬菜以及动物组织中。其化学性质稳定且很难被生物降解[3]，易被人体吸收产生巨大危害，可通过食物链放大逐级传递[4]。膳食暴露是PAEs，PAHs这些持久性污染物进入人体的主要途径[5-7]，食品中持久性污染物残留问题已受到国际社会广泛的关注。食用油是这些持久性污染物PAHs，PAEs通过饮食进入人体的主要途径之一[8-11], PAHs，PAEs含量水平成为评价食用油质量安全的重要指标[12-16]。因此，研究PAE及PAH的高效检测方法，对更为全面地监测和评价食用油污染状况[17-19]，保证食用油质量安全具有重要意义。

目前PAHs较多采用液相色谱法(HPLC)和气相质谱法(GC-MS)[20]，该方法时间较长，干扰较大。PAEs较多采用GC-MS法，该方法对部分复杂样品干扰较大，易出现假阳性结果，检验标准相对单一、低效、滞后[21-22]。相较于传统方法，GC-MS/MS具有较高灵敏度和分辨率，能够更有效地消除其他杂质的干扰，提高离子选择性和准确性[12]，并降低了检测限度。多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)为食用油中微量持久性污染物的检测提供新的有效手段[23]。由于食用油样品基质干扰复杂，建立快速有效检测植物油中持久性污染物PAEs和PAHs的技术很有必要。本研究使用低温除脂微萃取技术，结合GC-MS/MS的高灵敏、高选择性，建立了检测食用植物油中PAHs和PAEs的新方法，并进行了实际应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

标准物质：6种PAEs对照品,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司:邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)99.5%、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)99.5%、邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)99.5%、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)99.4%、邻苯二甲酸二戊酯(di-N-pentyl phthalate,DPP)99.0%、邻苯二甲酸二己酯(di-n-hexyl phthalate,DHXP)99.5%。14种PAHs标准品,Sigma公司: 萘(naphthalene，NAP)(2 000±20.39)mg/L,99.9%；苊烯(acenaphthylene,ANY)(2 000±7.22) mg/L,99.7%；蒽(anthracene，ANT)(2 004±20.44)mg/L,99.2%；荧蒽(fluoranthene，FLT)(1 999±4.48) mg/L,99.2%；菲(phenanthrene，PHE)(2 000±4.48)mg/L,99.5%；芴(fluorene，FLU)(2 003±10.79)mg/L,99%；苊(acenaphthene，ANA)(2 001±10.78) mg/L,99%；芘(pyrene，PYR)(2 001±4.49) mg/L,98.4%；苯并(a)蒽(benzo(a)anthracene，BaA)(2 002±20.42) mg/L,99%；(chrysene，CHR)(2 002±20.42) mg/L,98%；苯并(b)荧蒽(benzo[b] fluoranthene，BbFA)(2 000±4.48)mg/L,99.8%；苯并(k)荧蒽(benzo[k] fluoranthene，BkFA)(2 000±4.48)mg/L,99.3%；苯并(a)芘(benzo[a] pyrene，BaP)(1 998±4.48) mg/L,99.5%，二苯并(h)蒽(dibenz[a,h] anthracene，DhA)(2 001±10.78) mg/L,99.5%。

试剂：乙腈、正己烷、石油醚、甲醇、二氯甲烷(色谱纯),默克公司；8000D气相色谱-质谱仪，安捷伦公司；ME403分析天平，梅特勒托莱多公司；GENIUS3涡旋混合仪，德国IKA公司；GVA50A氮吹仪，北京普立泰科仪器有限公司；0.1～10 mL移液枪，德国Eppendorf公司；B-400均质仪，瑞士BUCHI公司。

1.1.2 仪器

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取1.0 g食用油样品，置于20 mL比色管中, 丙酮作为分散剂，加入10 mLV(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1溶剂，于涡旋混合器上旋涡提取(2 000 r/min)0.5 min，再超声萃取8 min，10 000 r/min离心5 min，使溶液充分分层后，置于-20 ℃冷冻除脂60 min，将上层清液倒入氮吹管中，低温氮吹至干，准确加入二氯甲烷2 mL，涡旋5 s，转移至进样瓶中，上机检测。试剂空白样，除不加样品外，其他操作相同。

1.2.2 气相色谱-质谱检测

1.2.2.1 色谱条件

色谱柱：DB-5MS 毛细管柱(Agilent19091S-433UI,30 m×250 μm×0.25 μm)；载气纯度高于99.999%的高纯氮气，流速1.0 mL/min;进样口温度250 ℃，不分流进样，进样体积为1μL;升温程序：初始柱温70 ℃，保持2 min，以 25 ℃/min 升温至150 ℃，保持1 min， 再以3 ℃/min 升温至200 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升温至280 ℃，保持10 min。

1.2.2.2 质谱条件

电子轰击离子源：电离能量70 eV，离子源温度250 ℃，传输线温度280 ℃，溶剂延迟5 min,灯丝电流100 μA，MRM多反应检测模式，其具体参数见表1。

表1 多重反应监测参数

2 结果与分析

2.1 前处理方法的建立

2.1.1 分散剂的选择

考察了丙酮、乙腈、乙醇和甲醇4种分散剂对目标物萃取效率的影响。结果表明,除了萘在乙醇作分散剂时萃取效率略微比丙酮高之外，其余19种污染物均在丙酮做分散剂时萃取效率最高，故选择丙酮作为分散剂。

2.1.2 萃取剂的选择

本文选用10 μg/L混合标准溶液进行加标实验，分别选用3种不同体系V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1、V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1、V(乙腈)∶V(丙酮)=1∶1多环芳烃萃取剂进行加速溶剂萃取试验，如图1所示，不同提取液提取效率不尽相同，总体呈现出二环、五环和六环的PAHs提取效率较低，三环和四环的 PAHs提取效率较高。其中，二氯甲烷-丙酮萃取平均回收率是82.1%～101%，对20种污染物均能达到较为满意的萃取率，正己烷-丙酮和乙腈-丙酮萃取平均回收率分别为64.5%～88.3%、53.8%～85.6%，DMP、ANY、DEP、BkFA和BaP的回收率较低，平均萃取效果不如二氯甲烷-丙酮，综合考虑各个目标物定量的准确性，试验确定V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1混合溶剂(下简称二氯甲烷-丙酮溶剂)作为样品的萃取剂。

1-NAP;2-DMP;3-ANY;4-ANA;5-DEP;6-FLU;7-PHE;8-ANT;9-DIBP;10-DBP;11-FLT;12-PYR;13-DPP;14-DHXP;15-BaA;16-CHR;17-BbFA;18-BkFA;19-BaP;20-DhA

2.1.3 萃取方式的选择

称取1 g待测样，加入2、5、10、12、15 mL二氯甲烷-丙酮萃取溶剂，涡旋分散30 s，再超声1、2、5、8、15 min后提取，考察萃取剂体积和超声萃取时间对萃取率的影响，结果如图2所示，萃取溶剂加入量10 mL，涡旋分散30 s，再超声萃取8 min为最佳萃取方式。

图2 不同萃取方式对提取效果的影响

2.1.4 冷冻时间的优化

称取1 g待测样，加入10 mL二氯甲烷-丙酮溶剂，涡旋分散30 s再超声萃取8 min后，分别选择温度为-4、-10、-15、-20、-25 ℃，分别放置10、30、60、90、120、150、200 min冷冻除脂，考察冷冻温度和冷冻时间对除脂净化的影响，结果如图3所示，-20 ℃冷冻除脂60 min为最佳冷冻条件。冷冻后，上层提取液可方便地倾入鸡心瓶中，实现与油脂充分分离。

图3 冷冻脱脂时间的优化

2.1.5 反萃取剂的选择及用量

称取1 g待测样，加入10 mL二氯甲烷-丙酮溶剂，涡旋分散30 s再超声萃取8 min，高速离心等溶液分层后，置于-20 ℃冷冻除脂60 min，考虑反萃取效果，将低温脱脂的溶剂蒸干，选择40°水浴，旋转蒸发时，当旋蒸至近干时， NAP损失较为严重， ANY、ANA也有一定的损失，因此，选用低温氮气吹干，可有效避免上述损失。选择常用的乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷作为反萃取剂，加入量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，比较其回收率，结果如图4所示，最终选择用2 mL二氯甲烷对其进行反萃取。

图4 反萃取剂的选择

2.2 GC-MS/MS检测技术的建立

2.2.1 质谱条件的优化

以全扫的方式对20种目标物进行扫描，获得其总离子流图，根据质谱图，选择分子量较大，丰度较高且干扰较少的碎片作为特征离子，见图5。

1-NAP;2-DMP;3-ANY;4-ANA;5-DEP;6-FLU;7-PHE;8-ANT;9-DIBP;10-DBP;11-FLT;12-PYR;13-DPP;14-DHXP;15-BaA;16-CHR;17-BbFA;18-BkFA;19-BaP;20-DhA

2.2.2 线性范围与检出限

由于持久性污染物在大自然界中普遍存在且不容易降解，在空白溶液中均有检出，本实验采取扣除空白样品的方法，以消除试剂本底对检测结果的影响，实验发现，样品基质对目标分析物的基质效应既有增强也有抑制，因此采取基质配标来降低基质效应的影响，以提高定性、定量的准确度，结果见表2。

表2 植物油中20种PAEs和PAHs的线性方程、相关系数、检出限及定量限

续表2

序号化合物线性方程相关系数LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)6芴(FLU)Y=173 537X0.997 30.430.947菲(PHE)Y=231 534X0.996 70.460.768蒽(ANT)Y=352 436X0.995 80.500.939邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)Y=54 739.3X0.997 21.764.8910邻苯二甲酸二丁酯(DBP)Y=53 728.1X0.998 21.514.3311荧蒽(FLT)Y=32 483.4X0.998 90.411.2112芘(PYR)Y=635 849X0.995 80.441.0013邻苯二甲酸二戊酯(DPP)Y=264 748X0.998 31.364.2314邻苯二甲酸二己酯(DHXP)Y=87 629.7X0.995 91.584.5415苯并(a)蒽(BaA)Y=638 291X0.996 10.350.9116(CHR)Y=183 947X0.997 30.250.7617苯并(b)荧蒽(BbFA)Y=201 867X0.997 10.280.8718苯并(k)荧蒽(BkFA)Y=83 693.4X0.996 20.461.0219苯并(a)芘(BaP)Y=377 890X0.996 90.491.1820二苯并(h)蒽(DhA)Y=28 492.3X0.997 80.380.87

2.2.3 提取净化方法的验证

选取空白的植物油样本，分别添加10、20、30 μg/kg的标准混合溶液，按照前处理方法进行加标回收和精密度试验，结果如表3所示：平均回收率为51.34%～116.2%，相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为0.9%～12.1%。结果表明，20种待测化合物加标回收率均在70%～120%。

表3 20种多环芳烃和增塑剂的回收率与相对标准偏差(n=5) 单位：%

2.4 食用油实际样品检测

应用本方法检测了市售8种食用油，每个样品重复检测2次，从表4可以看出，不同种类、不同生产日期、不同包装的食用油都检出PAEs和PAHs。8个油样中全部检出DBP和BaP，其含量分别在3.3～106.7 μg/kg和0.4～5.6 μg/kg。6个油样中检出DMP，其含量为39.3～265.1 μg/kg。所有油样中没有检测出ANY，对照GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》油脂中BaP规定限量为5 μg/kg，GB 9685—2008 中规定DBP≤0.3 mg/kg，本实验所测定的8种食用油中BaP超标率12.5%，DBP超标率为0，其他能检测出的PAEs和PAHs在国家限量标准中并未列出，而欧盟委员会835/2011号文件规定油脂中BaP的最高残留限量值为2 μg/kg，4种PAHs(BaA、CHR、BFA、BaP)之和的限量为10 μg/kg。欧盟“食品接触塑料材料和制品法规”中规定了DBP含量≤0.05%。几乎每种食用油中均有不同程度的PAEs和PAHs检出，这可能与食用油包装材质中污染物迁移有关，也可能与油脂生产中所用加工助剂以及设备和管件材质有关。

表4 不同食用油中塑化剂和多环芳烃含量的检测结果 单位：μg/kg

注：ND为未检出，NQ为定量限

3 结论

建立了快速测定植物油中6种邻苯二甲酸酯(PAEs)和14种多环芳烃(PAHs)的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析方法。20种目标物在5～200 μg/L范围内呈良好线性，线性相关系数均大于0.995，方法定量下限为1.0 μg/kg。在10、20、30 μg/kg 3个加标水平下的平均回收率为51.34%～116.2%，相对标准偏差为0.9%～12.1%。说明该技术适用于20种PAHs和PAHs的检验前处理，方法简便、快捷、准确，可用于植物油中增塑剂和多环芳烃残留的检测，为植物油的质量控制和安全评价提供了保证。对实际样品进行检测，均检出PAEs和PAHs，对照国内限量BaP超标率12.5%。不合格率远低于欧盟标准，国家限量标准有待完善。