复合天然保鲜剂对冷却羊肉的保鲜效果

薛婉瑞，张海生，赵鑫帅，薛菁，辛相余

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

冷却羊肉肉质细嫩、营养全面，含有丰富的维生素、磷、钙、铁等，尤其是钙和铁的含量显著超过了牛肉和猪肉，且脂肪含量、胆固醇含量较其他肉类低，营养成分更容易被人体吸收，因此冷却羊肉越来越畅销，销售范围越来越广。但冷却羊肉从屠宰、排酸到切割、运输、销售等环节都会出现微生物污染、蛋白质及脂肪氧化、色泽劣变等问题，导致其货架期只有3～4 d[1]，这严重制约了冷却羊肉的销售及发展。因此，如何解决上述问题并延长冷却羊肉的货架期，一直是近年来的研究热点。

目前，关于冷却羊肉的保鲜使用最广泛的是直接添加防腐剂，我国食品中使用的防腐剂主要有苯甲酸及其钠盐、对羟基苯甲酸及其酯类、丙酸及其钠盐、二甲基二碳酸盐等[2]，这些人工合成化学保鲜剂的副作用几乎不可避免，潜在威胁着人体健康[3]。因此，安全性强、绿色环保、无毒副作用的天然保鲜剂备受关注。其中用于肉类保鲜的主要有：壳聚糖、溶菌酶、天然香辛料提取物、茶多酚、乳酸链球菌素等[4-7]。其中，壳聚糖有游离的氨基和羟基，因此具有较好的生理活性，对菌落有很好的抑制作用[8]。茶多酚具有很有的抗氧化性，因此对很多种细菌均具有很好的抑菌效果[9]，据罗爱平等[10]研究，茶多酚在冷却肉贮藏过程中可以有效地防止油脂氧化褐变。纳他霉素对真菌具有很好的抑制作用[11]，李东等[12]发现纳他霉素对酵母菌以及大多数霉菌具有很好的抑菌效果。百里香和丁香在肉类中使用，不仅对大肠杆菌、葡萄球菌、黑曲霉菌等具有很好的抑制作用，还具有除膻的功效[13-16]。

许多研究表明，复合天然保鲜剂要比单一保鲜剂对于肉类的保鲜作用更加显著[17-18]。夏静华等[19]用茶多酚和壳聚糖复合对冷鲜羊肉的抑菌效果显著优于单一保鲜剂。施荷等[20]用茶多酚、丁香提取物、肉桂提取物对冷却鹿肉进行综合保鲜,发现经过复配保鲜剂处理后的冷却肉在冷藏期间可以更好地保持感官品质。王正云等[21]用茶多酚和壳聚糖复合涂膜保鲜冷却肉的效果显著优于单独使用壳聚糖涂膜。目前关于香辛料和茶多酚等天然保鲜剂协同使用，并应用于冷却羊肉的研究还鲜少见于报道。因此，本研究选取壳聚糖、茶多酚、纳他霉素以及香辛料(百里香和丁香)4种天然保鲜剂，研究其对冷却羊肉的抑菌效果，通过响应面优化得出其最佳复配方法，并对此方案的保鲜效果进行探究，以期为复合天然保鲜剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 实验仪器

FW400A高速万能粉碎机，北京科伟仪器公司；BS224S电子天平，德国Sartorius公司；Z-206A离心机，德国Hemle公司；LC-167J型冰箱，青岛海尔特种冰柜有限公司；HWS24电热恒温水浴锅，上海一恒科技公司；SG2型pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；C-LM3B数显式肌肉嫩度仪，北京龙德泰达生物技术有限公司；CR-400色差仪，Konica Minolta(日本)公司。

1.1.2 材料与试剂

山羊肉，横山香草羊肉制品有限责任公司；水溶性壳聚糖(含量99.2%，脱乙酰度≥90%)、茶多酚(含量≥95%)，河南金诚有限公司；纳他霉素(含量≥95%)，浙江新银象生物工程有限公司；百里香、丁香，榆林农贸市场。以上材料均为食品级。

试剂：95%乙醇、甲基红、溴甲酚绿、MgO、(NH4)2SO4、NaOH、Na2CO3、硼酸，均为国产分析纯。

供试菌：乳酸菌(lactic acid bacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcus)、热死环丝菌(Brochothrixthremasphacta)、酵母菌(Saccharomyce)，均为作者所在实验室从冷却羊肉中分离鉴定所得,培养条件如表1所示。

表1 不同微生物菌相的培养条件

1.2 实验方法

1.2.1 单一保鲜剂的抑菌效果

(1)保鲜剂的配制

配制质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的水溶性壳聚糖溶液备用;配制质量浓度为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 g/L的茶多酚溶液备用;配制质量浓度为0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 g/L的纳他霉素溶液备用;香辛料溶液：选取优质、干燥的百里香和丁香，经高速粉碎后，过40目筛，各称3 g，分别溶于100 mL蒸馏水，80 ℃水浴2 h后离心(3 000 r/min, 15 min)，取出上清液，等体积混合(各取50 mL)，制成60 g/L的水提液，依次用蒸馏水稀释为质量浓度20、30、40、50、60 g/L的溶液备用。

(2)单一保鲜剂的抑菌效果

活化菌种后，将不同菌液配制成含菌数为106～107CFU/mL的菌悬液，选取内径为6 mm的牛津杯干热灭菌并采用牛津杯试验方法[22-23]对单一保鲜剂的效果进行测定。

(3)最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)的测定

抑菌圈直径>6 mm所对应的保鲜剂的浓度即为最小抑菌浓度。

(4)羊肉的处理方法

将新鲜的冷却羊肉切成50 g左右均匀块状，涂抹保鲜剂，保鲜膜封装，在0～4 ℃的冷柜中保存。在第14天时，对其挥发性盐基氮指标进行测定。

1.2.2 响应面优化

在所选取的4种保鲜剂抑菌试验的基础上，根据响应面Box-Behnken设计原理，选取四因素三水平的响应面分析方法，以TVB-N值为响应值，用Design Expert 8.0.5软件进行数据的统计处理，得出最佳工艺参数。因素及水平编码见表2。

表2 Box-Behnken设计因素和水平编码表 单位：g/L

1.2.3 复合天然保鲜剂的保鲜效果测定

采用复合保鲜剂(壳聚糖1.8 g/L、茶多酚2.8 g/L、纳他霉素0.4 g/L、香辛料44.4 g/L)对冷却羊肉进行涂抹处理，同时设对照组(未经保鲜剂处理的肉块)，封装后放置4 ℃的冷柜中贮藏，每隔3 d，对各项指标进行一次测定。

(1)菌落总数：按照GB 4789.2—2010方法进行测定。

(2)pH：按照GB/T 9695.5—2008方法进行测定。

(3)挥发性盐基氮：按照 GB 5009.228—2016进行测定。评价标准为新鲜肉为15 mg/100 g以下，冷鲜肉为20 mg/100 g以下，变质肉为20 mg/100 g以上[24]。

(4)汁液流失率：对涂抹保鲜剂后的肉块进行称重，每隔3 d后取出托盘中的肉块，使用吸水纸将肉块表面的汁液吸去，称其质量，按公式(1)计算

(1)

式中：m,涂抹后的羊肉质量,g；m1,每隔3 d后的羊肉质量,g。

(5)蒸煮损失率：将肉块放置于蒸煮袋中，待水浴锅的温度达到80 ℃时，将肉块放置其中蒸煮，当肉样中心温度达到70 ℃时取出，冷却至室温再次称重，计算公式如下：

(2)

式中：m,蒸煮前的肉质量,g；m2,蒸煮后的肉质量,g。

(6)剪切力：将待测肉块放置于蒸煮袋中，待水浴锅的温度达到80 ℃时，将肉块放置其中蒸煮，当肉样中心温度达到70 ℃时取出，冷却至室温，用取样器垂直肌纤维方向取样(取出的样品呈柱状)，然后横向放置于数显式肌肉嫩度仪上，测定其剪切力，剪切力用kg·f表示。

(7)色泽：先对色差仪进行校正，然后测定待测肉块的L*值(亮度)、a*值(红度)、b*值(黄度)及c*(饱和度)、h°(色调角)值，每次测定均在相同环境下进行，每个待测肉样进行5次平行测定，结果取平均值。

(3)

(4)

1.2.4 数据分析

采用Design-expert软件和SPSS 17.0 软件(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)对测定的数据进行处理分析。不同字母表示在0.05水平上差异性显著。

2 结果与分析

2.1 单一保鲜剂的抑菌效果

2.1.1 壳聚糖的抑菌效果

如图1所示，随着壳聚糖浓度升高，酵母菌的抑菌圈直径几乎不变，大肠杆菌、乳酸菌一直在增加，假单胞菌、葡萄球菌先升后降。可见，壳聚糖对酵母菌以外的5种菌落均有较为显著的抑制效果，壳聚糖浓度为2.0 g/L时，对冷却羊肉腐败菌的优势菌落假单胞菌的抑制作用最好。壳聚糖浓度为2.5 g/L时，对肠杆菌科、热死环丝菌的抑制作用最好，对乳酸菌及葡萄球菌的抑菌效果有所下降。

图1 壳聚糖对不同菌株的抑制效果

2.1.2 茶多酚的抑菌效果

如图2所示，随着茶多酚质量浓度升高，各菌株抑菌圈直径变化都较显著，乳酸菌的抑菌圈直径在茶多酚质量浓度为7.0 g/L时最显著；超过7.0 g/L时，大肠杆菌、葡萄球菌、乳酸菌的抑菌圈直径反而下降；茶多酚质量浓度为9.0 g/L时，对热死环丝菌和酵母菌抑制效果显著。可见，茶多酚对各种细菌均有较好的抑制作用，但浓度不同，抑制效果最佳的菌株也不同。

图2 茶多酚对不同菌株的抑制效果

2.1.3 纳他霉素的抑菌效果

如图3所示，随着纳他霉素浓度的升高，酵母菌的抑菌圈直径增加幅度较大，葡萄球菌有很小变化，其他菌株抑菌圈直径几乎不变。这是由于纳他霉素对几乎所有的霉菌和酵母都具有抗性，但对细菌和病毒则无效。可见纳他霉素对酵母菌有明显的抑制作用，且随着纳他霉素浓度的升高，抑制效果显著提高。

图3 纳他霉素对不同菌株的抑制效果

2.1.4 香辛料的抑菌效果

如图4所示，随着香辛料浓度的升高，乳酸菌和酵母菌抑菌圈的直径变化不大，其他菌株的抑菌圈直径在香辛料浓度≤50 g/L时，变化也不大。香辛料浓度为60 g/L时，假单胞菌的抑菌圈直径变化最显著，大肠杆菌、葡萄球菌其次。由此可见，香辛料对乳酸菌和酵母菌无明显抑制效果，对其他腐败菌有抑制作用，但在其低浓度时抑制效果并不明显，当浓度达到60 g/L时，对假单胞菌抑制效果最显著，大肠杆菌、葡萄球菌和热死环丝菌抑制效果较好。

图4 香辛料对不同菌株的抑制效果

2.2 响应面优化结果

2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析

基于上述单一保鲜剂抑菌试验的结果，以挥发性盐基氮[24](TVB-N)为响应值，通过四因素三水平的Box-Behnken试验设计和响应面分析方法，确定复合保鲜剂的最佳配比，结果见表3。

表3 Box-Behnken试验结果

续表3

序号壳聚糖X1/( g·L-1)茶多酚X2/( g·L-1)纳他霉素X3/( g·L-1)香辛料X4/( g·L-1)挥发性盐基氮/[mg·(100 g)-1]19-101013.3120101014.01210-10-112.9922010-113.86230-10111.5124010114.792500008.232600009.052700008.292800007.932900008.38

应用Design Expert软件对结果进行分析，各试验因素对响应值的影响可用以下多元二次回归方程(未去除不显著项)表示：

1/R=0.12+0.009 242X1-0.002 639X2-0.002 743X3+0.003 034X4-0.000 614 8X1X2-0.01X1X3+0.007 487X1X4-0.002 209X2X3-0.003 609X2X4+0.001 427X3X4-0.014X12-0.022X22-0.025X32-0.022X42

表4 响应面分析试验方差结果

2.2.2 两因子交互作用分析

根据回归方程作3D曲面图，考察其形状与颜色变化，分析茶多酚、壳聚糖、纳他霉素、香辛料对于响应值的影响。各因素对TVB-N值的影响的响应面见图5。

图5-a显示了在纳他霉素和香辛料为最佳值时(C=0.4，D=44.4)，本实验水平范围内，壳聚糖和茶多酚两因子交互作用不显著。随着壳聚糖和茶多酚浓度的增大，TVB-N值先减小后增大，且茶多酚对TVB-N值的影响比壳聚糖的影响弱。

a-壳聚糖和茶多酚;b-壳聚糖和纳他霉素;c-壳聚糖和香辛料;d-茶多酚和纳他霉素;e-茶多酚和香辛料;f-纳他霉素和香辛料

图5-b显示了茶多酚和香辛料处于最佳水平(B=2.8，D=44.4)时，本实验水平范围内，壳聚糖和纳他霉素两因子交互作用极显著。随着壳聚糖和纳他霉素浓度的增大，TVB-N值先减小后增大，并且当壳聚糖浓度增大时，TVB-N值不断减小，说明壳聚糖对TVB-N值有很好的抑制作用。图5-c显示了在茶多酚和纳他霉素为最佳值(B=2.8，C=0.4)时，本实验水平范围内，壳聚糖和香辛料两因子交互作用显著。随着壳聚糖和香辛料浓度的增大，羊肉的TVB-N值不断减小，再继续增大时TVB-N值反而随之增大。图5-d显示了在壳聚糖和香辛料为最佳值(A=1.8，D=44.4)时，本实验水平范围内，茶多酚和纳他霉素两因子交互作用不显著。随着茶多酚和纳他霉素浓度的增大，羊肉的TVB-N值不断减小，但再继续增大时TVB-N值会迅速增大。图5-e显示了在壳聚糖和纳他霉素为最佳值(A=1.8，C=0.4)时，本实验水平范围内，茶多酚和香辛料两因子交互作用不显著。随着茶多酚和香辛料浓度的增大，羊肉的TVB-N值呈现出先减小后增大的趋势。图5-f显示了在壳聚糖和茶多酚为最佳值(A=1.8，B=2.8)时，本实验水平范围内，纳他霉素和香辛料两因子交互作用不显著。随着纳他霉素和香辛料浓度的增大，羊肉的TVB-N值先减小后增大。

2.2.3 最优条件的确定和验证

通过Design Expert软件对最佳配方进行预测，获得冷却羊肉复合保鲜剂最佳配方为：壳聚糖0.18%、茶多酚0.28%、纳他霉素0.04%、香辛料4.44%，羊肉的TVB-N理论值为7.86 mg/100 g，为检验响应曲面法优化结果的可靠性，采用上述试验参数对冷却托盘羊肉进行涂抹处理，在4 ℃条件下贮藏14 d后，对其TVB-N值进行测定，得到其实际值为7.47 mg/g。验证值与理论值间的匹配度达95.04%，说明利用该模型对冷却羊肉复合保鲜剂的配方进行优化是可行的，得到的工艺参数具有实际应用价值。

2.3 复合保鲜剂对冷却羊肉菌落总数的影响

2.3.1 复合保鲜剂对冷却羊肉菌落总数的影响

如图6所示，随着贮藏时间的延长，冷却羊肉的菌落总数均逐渐增加，对照组的增幅显著大于处理组。贮藏6 d时，对照组的菌落总数达到6 lg(CFU/g)，已超过国家规定的冷鲜羊肉允许的菌落总数106CFU/g，而处理组冷却羊肉在贮藏15 d时，其菌落总数仅为5.11 lg(CFU/g)，低于国家规定。这是因为壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，溶解后的溶液中含有氨基(NH2+)，这些氨基结合负电子可以有效地抑制细菌生长繁殖。茶多酚可以增加细胞通透性，并与遗传物质结合，干扰微生物的生长和繁殖，使其正常生长受到抑制[25]。且用复配的保鲜剂处理冷却肉协同抑菌效果更好。

图6 冷却羊肉菌落总数的变化

2.3.2 复合保鲜剂对冷却TVB-N的影响

图7为复合保鲜剂对冷却羊肉的TVB-N值的影响，TVB-N值是反映肉类蛋白质被分解程度的重要指标，TVB-N值越大表示肉类腐败程度越高。随着贮藏时间的延长，冷却羊肉中TVB-N值不断增加。贮藏0～9 d，对照组冷却羊肉中TVB-N值增幅较小，9～15 d，增幅变大，贮藏15 d时，对照组冷却羊肉中TVB-N值达到16.29 mg/100 g，超过了鲜肉中TVB-N值的最大允许值15 mg/100 g，属于次鲜肉。而处理组冷却羊肉中TVB-N值仅为7.47 mg/100 g，仍为鲜肉等级。在肉的贮藏过程中，蛋白质的分解主要是由细菌引起的，可见本研究所使用的复合保鲜剂对冷却羊肉的菌落控制有很好的效果，由TVB-N值指标可知，经保鲜剂处理的托盘冷却羊肉的货架期可达15 d以上。

图7 冷却羊肉TVB-N值的变化

2.3.3 复合保鲜剂对冷却羊肉pH的影响

图8为复合保鲜剂对冷却羊肉pH的影响，由于宰后羊肉中糖原酵解产生乳酸，乳酸积累从而导致羊肉pH下降，其大小影响蛋白质间的斥力，因此对羊肉的持水性有很大影响。随着贮藏时间延长，两组样品的pH均呈下降趋势。第9天时，对照组pH已降至5.53，接近蛋白质等电点，羊肉的持水性较低。相比，处理组的pH在第6天逐渐趋于稳定状态，远离蛋白质等电点，羊肉持水性较好。除此之外，pH值还与菌落的生长有密切关系，在弱酸性条件下，细菌和霉菌均较为适宜生长。因此，可以得出复合保鲜剂可以减缓冷却羊肉pH下降的速度，延长冷却羊肉的货架期。

图8 冷却羊肉pH的变化

2.3.4 复合保鲜剂对冷却羊肉保水性的影响

羊肉在贮藏期间，由于蛋白质净电荷以及肌肉组织结构发生变化，使得细胞内水分不断向外扩散，会造成保水性降低的问题，表现为汁液流失增加，蒸煮损失增加，这些问题不仅造成了羊肉营养物质的流失，还严重影响羊肉的外观品质。因此，本试验对其汁液流失率以及蒸煮损失率进行了测定，结果如图9所示。

图9 冷却羊肉保水性的变化

可以看出，随着贮藏天数的延长，两组的汁液流失率均逐渐增加。对照组样品的汁液流失率显著高于处理组，贮藏15 d后，汁液流失率高达6.35%，处理组样品在贮藏12 d时汁液流失率达到最高值，但仅为1.15%。同时，两组样品的蒸煮损失率均没有很大的变化。且两组样品的蒸煮损失率之间没有显著性的差异(P>0.05)，可见复合保鲜剂不会影响托盘冷却羊肉的蒸煮损失率。可能是由于保鲜剂复配处理后，对冷却羊肉中微生物的抑制效果增强，阻止了由微生物引起的腐烂从而导致组织结构被破坏，从而造成汁液流失。同时适宜浓度的壳聚糖具有的良好的成模性使之在羊肉表面形成了一层膜，也很好的阻止了羊肉水分的流失[21]。

2.3.5 复合保鲜剂对冷却羊肉剪切力的影响

剪切力是反映肉样软硬程度，弹性强弱的重要指标之一，是直接评判肉样品质的重要参数。因此，本试验对羊肉的剪切力进行了测定，其结果如图10所示。

图10 冷却羊肉剪切力的变化

随着贮藏时间的延长，2组样品的剪切力均呈现出增长的态势。对照组样品的剪切力随贮藏时间的延长变化较为明显，在第12天时，剪切力已经达到了4.39 kg·f，肉质已经较硬，影响了羊肉的口感。相比对照组，处理组样品的剪切力随贮藏时间的延长，变化幅度较小，始终保持在3.00 kg·f以下，与第0天的羊肉的剪切力相差较小，最大程度上保留了羊肉原有的嫩度。可能是因为在贮藏期间，腐败微生物生长繁殖破坏了肌肉细胞结构，肌原纤维发生变化，使得冷却肉的保水性发生变化，出现汁液流失现象，从而造成冷却肉肌肉硬度上升，而保鲜剂复配处理能够通过抑制微生物繁殖有效减缓冷却羊肉硬度值上升的趋势，从而有效保持冷却羊肉的嫩度。

2.3.6 复合保鲜剂对冷却羊肉色泽的影响

色泽是消费者通过眼睛直接评判羊肉品质的直接指标，本实验测定了托盘冷却羊肉在贮藏期间的色泽变化，结果如表5所示。由表5结果分析可知，随着贮藏天数的延长，羊肉的L*值(亮度)、a*值(红度)、b*值(黄度)、c*(饱和度)和h°(色调角)均发生了不同程度的变化。

表5 冷却羊肉色泽的变化

注：结果表示为5次测定的平均值±标准差；不同的小写字母表示在0.05显著性水平上差异显著

对照组和处理组的L*值均随着贮藏天数的延长不断下降，但处理组L*值的降幅明显小于对照组(P<0.05)。a*值随着贮藏天数的延长也会不断下降，但处理组a*值的下降速度比对照组a*值下降速度慢，处理组第15天时，a*值与对照组第9天时的a*值接近，差异性不显著(P>0.05)。b*值均随着贮藏天数的延长而不断变大，但是处理组增幅明显小于对照组的增幅，处理组第15天时的b*值与对照组第9天时的b*值接近，差异性不显著(P>0.05)。处理组在第15天时的c*值与对照组第6、9天时的c*值接近，差异性不显著(P>0.05)。对照组和处理组的h°值随着贮藏时间的延长不断增大，而且增幅明显(P<0.05)，但是，处理组h°值的增幅明显低于对照组(P<0.05)。可见，复合保鲜剂可以有效延缓L*值、a*值、b*值、c*和h°的变化。

因为c*值和h°值只与a*值和b*值有关，因此可以得出复合保鲜剂对冷却羊肉a*值和b*值的变化均具有较好的抑制作用。这是因为色泽的变化主要是由于羊肉氧化而引起的褐变所造成的，而保鲜剂中的茶多酚具有很强的抗氧化性，因此，经过复合保鲜剂处理的冷却羊肉一定程度上减轻了氧化所造成的褐变，从而有效的减轻了羊肉色泽的劣变。

3 结论

综合分析以上实验结果，在0～4 ℃贮藏条件下，天然保鲜剂对冷却羊肉腐败菌具有明显的抑制作用，且通过Box-Behnken试验得出最佳的复合保鲜剂配方，即壳聚糖0.18%、茶多酚0.28%、纳他霉素0.04%、香辛料4.44%。使用上述复合保鲜剂处理冷却羊肉，可显著减缓羊肉菌落总数、TVB-N值的升高及pH的降低，延长冷却羊肉货架期至15 d以上，同时，对汁液损失率、蒸煮损失率、剪切力和色泽等羊肉的重要品质均产生有利的影响，降低水分流失，减轻褐变，很好地保持了冷却羊肉原有品质，说明上述配方的复合保鲜剂对冷却羊肉有很好的防腐保鲜效果。